单细胞测序筛选原发和复发胶质母细胞瘤中恒定存在的胶质瘤细胞

Exploring the Difference between Newly Diagnosed and Recurrent Glioblastoma by Screening a Constant Tumor Cell Type via Single-Cell Sequencing

摘要: 目的：胶质母细胞瘤是成人最常见、侵袭性最强的原发性高致死性脑肿瘤。基因表达似乎是预测胶质母细胞瘤患者生存和治疗反应的重要因素。然而，不同患者之间肿瘤细胞的异质性可能会阻碍找到一种癌症的恒定治疗靶点，因为不仅ndGBM和rGBM之间的遗传谱不同，不同患者之间甚至同一患者的肿瘤细胞亚群之间的遗传谱也不同。因此，在不同的ndGBM和rGBM患者中发现一种恒定的肿瘤细胞类型可能是更好地治疗胶质母细胞瘤的一种潜在方法。本文通过单细胞测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)筛选恒定的肿瘤细胞类型，比较新诊断的胶质母细胞瘤(ndGBM)和复发性胶质母细胞瘤(rGBM)组的遗传机制。方法：从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库(GSE182109)下载3例ndGBM患者(3例样本)和2例rGBM患者(7例样本)胶质母细胞瘤样本的基因表达谱，并使用R包进行scRNA-seq。结果：共有59,400个胶母细胞瘤组织细胞及12,172个胶质瘤细胞最终通过质控，本研究成功筛选出了恒定的胶质瘤细胞亚型。此外，本研究还进行了拟时序分析、基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析、细胞–细胞相互作用和单细胞调控网络推测聚类。本研究还鉴定了ndGBM和rGBM组的关键基因基因和各组的不同功能。结论：本文筛选了WHO IV级、IDH野生型和甲基化的胶质母细胞瘤中存在于每个样本和每个发展阶段的一类肿瘤细胞亚型。进一步的研究需要通过分子实验来验证分子机制，并针对这些靶点开发诊断方法和药物治疗ndGBM和rGBM。

Abstract: Objective: Glioblastoma is the most common and most aggressive primary highly lethal brain tumor in adults. Genetic expression seems to be an important factor to predict survival and treatment response in glioblastoma. Nevertheless, the heterogeneity of tumor cells among different patients may be an obstruction to find out a constant therapeutical target for one type of cancer, since the genetic profile is different not only between ndGBM and rGBM, but among different patients and even tumor cell subsets in one patient. Thus, finding a constant tumor cell type that exists across different patients in ndGBM and rGBM may be a potential approach to manage glioblastoma better. This article compares the genetic mechanisms between the newly diagnosed glioblastoma (ndGBM) and recurrent glioblastoma (rGBM) groups by screening a constant tumor cell type via single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). Method: The gene expression profile of glioblastoma samples obtained in 3 patients (3 samples) with ndGBM, and 2 patients (7 samples) with rGBM was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database (GSE182109), and scRNA-seq was conducted using R package. Result: Fifty-nine thousand and forty cells of glioblastoma tissue with 12,172 glioma cells were finally passed the quality control process, and a constant glioma cell type was screened. Pseudotime analysis, Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis, cell-cell interaction, and single-cell regulatory network inference and clustering for the constant tumor cell type were also conducted. Hub genes and different functions for the constant glioma cell type were also identified. Conclusion: Our article screened a kind of tumor cell subtype that exists across each sample and each development stage in IV level, IDH wild type, and methylated glioblastoma. Further studies are required to verify the resulting genes via molecular experiment, as well as to develop diagnostic methods and pharmaceutical therapies aimed at these targets in treating ndGBM and rGBM.

1. 引言

胶质母细胞瘤是成人最常见、侵袭性最强的原发性高致死性脑肿瘤 [1] 。胶质瘤的组织学分级可分为低分级(World Health Organization (WHO) I、II级)和高分级(WHO III、IV级)，而胶质母细胞瘤则为WHO IV级(恶性度最高) [2] 。新诊断的胶质母细胞瘤(newly diagnosed glioblastoma, ndGBM)的治疗策略包括最大范围的手术切除，并联合放疗和化疗(如替莫唑胺(temozolomide, TMZ))的综合治疗。然而，无论采用何种治疗方法，高达70%的胶质母细胞瘤患者将会复发 [3] [4] 。据报道，胶质母细胞瘤通常在ndGBM初次手术后6~8个月复发 [5] 。目前，对于复发性胶质母细胞瘤(recurrent glioblastoma, rGBM)没有标准的治疗方法。更糟糕的是，据我们所知，目前在提高胶质母细胞瘤患者生存率方面取得的成果有限，且还没有针对rGBM治疗的三期试验得出有效的结论 [6] 。据估计，ndGBM的中位总生存期约为15~17个月，5年生存率一般小于5% [7] 。

与胶质母细胞瘤预后相关的影响因素包括年龄、组织学分级、切除范围、皮质类固醇的使用、遗传因素等 [8] [9] 。研究表明，基因表达似乎是预测胶质母细胞瘤患者生存和治疗反应的重要因素 [10] [11] 。例如，研究发现编码异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)基因的点突变是胶质瘤发生发展的重要过程，这种突变在低级别胶质瘤中尤为常见，可能导致较高的生存率 [12] [13] 。O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)是一种DNA修复蛋白，通过去除鸟嘌呤O⁶位置的烷基，在对抗TMZ的细胞毒性和致突变活性中起到了关键作用 [14] 。据报道，一个细胞中MGMT蛋白的数量是修复TMZ诱导的遗传病变的限制因素，因为去除单个烷基后，MGMT会被不可逆地抑制 [15] 。既往研究表明，在接受TMZ治疗的复发性低级别胶质瘤中，高突变复发的MGMT启动子甲基化水平远高于非高突变复发的MGMT启动子甲基化水平 [16] [17] 。因此，考虑到遗传因素在胶质瘤治疗中的重要作用，有必要深入探讨ndGBM与rGBM的分子差异，这可能对预防胶质母细胞瘤的进展和复发、设计有效的靶向治疗方案具有重要意义。然而，不同患者之间肿瘤细胞的异质性可能会阻碍找到一种癌症的恒定治疗靶点，因为不仅ndGBM和rGBM之间的遗传谱不同，不同患者之间甚至同一患者的肿瘤细胞亚群之间的遗传谱也不同。因此，在不同的ndGBM和rGBM患者中发现一种恒定的肿瘤细胞类型可能是更好地治疗胶质母细胞瘤的一种潜在方法。

在过去几十年里，测序技术取得了重大进展。通过鉴定细胞亚群及其相互关系和发育模式，以及阐明基因表达和转录条件，单细胞RNA测序(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)使研究人员能够了解组织的生理和病理过程。据我们所知，虽然有几篇文章研究了ndGBM和rGBM之间的分子机制 [18] [19] ，但很少有文章应用了scRNA-seq，这可能会限制对两种胶质母细胞瘤深入研究。我们的研究通过基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获得了ndGBM和rGBM的scRNA-seq数据。为了在更深层次上比较两种胶质母细胞瘤之间的潜在差异基因，我们确定或推断了细胞类型、关系和发育过程，并测定了转录因子。一种恒定存在于各样本的胶质母细胞瘤细胞被筛选了出来。我们还对恒定细胞的差异表达基因(differential expressed genes, DEGs)在两组中的功能进行了分析，并筛选出了两组恒定细胞的关键基因。本文旨在比较这两组胶质母细胞瘤的分子机制。此外，由此产生的基因和通路可能有利于发现治疗ndGBM和rGBM的潜在诊断和治疗靶点。

2. 材料与方法

2.1. 数据和样本的收集

从GEO数据库下载ndGBM和rGBM患者的基因表达矩阵。使用GSE182109数据集进行生物信息学分析。本研究纳入的样本包括rGBM-01、rGBM-05、ndGBM-04、ndGBM-09和ndGBM-10，因为它们都是WHO IV级、甲基化和IDH野生型的胶质母细胞瘤。

2.2. 细胞聚类和注释

使用R包Seurat (3.1.1)创建Seurat对象，并经过质控、归一化(方法为“LogNormalize”)、降维和聚类流程。质控过程包括去除少于3个细胞中表达的基因，去除表达少于500个基因的细胞，去除线粒体DNA基因超过25%的细胞。在每个样本中选择了2000个高可变的基因。使用RunHarmony包对样本进行整合去批次。利用CellCycleScoring包评估细胞周期对聚类和注释的影响。采用UMAP方法对聚类进行可视化，分辨率设为2.5 (所有细胞)及1.0 (胶质瘤细胞)。利用FindAllMarkers函数将在每个细胞簇中超过10%的细胞中表达、并且其log2 Fold Change (FC)大于0.25的基因筛选为标记基因。通过FindMarker函数筛选ndGBM组与rGBM组之间各细胞类型的DEGs。选取在散点图上能够区分的、log2fc值较高的DEGs作为每个细胞簇的标记基因。本研究注释细胞类型参考了纳入数据集的原文献对细胞类型进行标注 [20] 。

2.3. 基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析

GO和KEGG是探索多基因潜在功能和通路的两个主要资源。利用在线富集分析工具metscape (http://metascape.org/gp/#/main/step1)对每种细胞类型中的DEGs进行GO和KEGG富集分析。P < 0.05认为有统计学意义。

2.4. 拟时序分析

本研究使用R包Monocle (http://cole-trapnell-lab.github)进行拟时序分析。将已经注释好的的Seurat对象转换为Monocle对象。利用orderCells函数将细胞沿发育轴排列以表示其推测的轨迹。

2.5. 细胞–细胞相互作用

使用R包CellChat (https://htmlpreview.github.io/?https://github.com/sqjin/CellChat/blob/master/tutorial/CellChat-vignette.html) 绘制细胞–细胞相互作用网络。将已经注释好的的Seurat对象转换为CellChat对象。使用identify OverExpressed Genes函数鉴定一种细胞类型中上调的配体或受体，然后使用project Data函数将基因表达数据投射到蛋白质相互作用网络中。只要配体或受体过表达，就使用identify Over Expressed Interactions函数筛选配体与受体的相互作用。CellChat将每个交互表现为一个概率值，并计算交互的显著值。概率值的计算既考虑了表达矩阵，又综合了相互作用的先验知识。位置。用细胞类型对假定的发育线着色。

2.6. 单细胞调节网络推断和聚类(Single-Cell Regulatory Network Inference and Clustering, SCENIC)

SCENIC是一种算法，可用于分析与转录因子(transcriptional factors, TFs)相关的调控网络，并识别细胞中的调控子。将注释好的Seurat对象导入SCENIC (0.9.1)。使用默认参数对基因进行筛选，并使用参考数据集human sapiens specific database (hg19)运行RcisTarget和SCENIC。利用GENIE3函数计算TFs与各调控子之间的相关性。然后使用runSCENIC对共表达式模块进行推测和验证。最后，通过AUCell (Area Under the Curve)算法对规则的活性进行评分，该算法使用默认阈值对特定规则进行二进制(“0”表示TFs的“关闭”，“1”表示“打开”)。通过calcRSS函数鉴定各细胞类型的排名考前的TFs，并按rss评分排序。利用热图表示差异表达的TFs。

2.7. 构建蛋白–蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络及关键基因的鉴定

互作基因检索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes, STRING11.0, http://string-db.org) (11.0)是一个在线分析的工具，用于绘制多个基因或蛋白质之间的功能相互作用。本研究使用STRING构建了ndGBM和rGBM之间DEGs的PPI网络。然后将在STRING中获得的结果加载到Cytoscape (3.7.1)中，Cytoscape是一个用于可视化PPI并将PPI与属性数据结合的开源软件。本研究根据Cytoscape的12种算法中的出现频率筛选每组的关键基因。

2.8. 统计学方法

采用SPSS 25.0 (IBM Inc. Armonk，纽约，美国)比较ndGBM组与rGBM组细胞数的差异。统计学方法采用卡方检验。P < 0.05，校正残差 > 4认为有统计学意义。

3. 结果

3.1. 目的胶质瘤细胞的筛选

本研究中共有59,040个细胞被分成0到40个细胞簇。图1(A)显示了基本的质量控制结果。图1(B)和图1(C)显示了聚类结果和细胞注释的结果。具体来说，41个集群注释成为7种细胞类型。胶质瘤细胞数目为12,172个。每个样品和两组中每种细胞类型的比例如图1(D)和图1(E)所示，可以看出，骨髓细胞在两组中所占比例最大，其次是胶质瘤细胞。最小的细胞类型包括周细胞和内皮细胞。从图1(F)可以看出，ndGBM中含有较多的B细胞、T细胞、胶质瘤细胞和周细胞，而rGBM中含有较多的髓细胞和少突胶质细胞。内皮细胞数量的差异无统计学意义。热图(图1(G))显示了每种细胞类型的前10个标记基因。接下来，本研究对胶质瘤细胞进行过滤筛选，重新聚类，并将其分成第0到21个细胞簇。本研究将22个细胞簇注释为8种细胞类型，细胞的聚类结果和注释结果如图2(A)和图2(B)所示，表明在纳入的样本中，除GC8外均被筛选得到(基于纳入数据集作者的研究注释结果)。热图(图2(G))显示了每种细胞类型的前10个标记基因。

(A) (B) (C) (D) (E) (F) (G)(A) 质量控制结果，每个点代表一个细胞。(B) R包Seurat聚类生成的结果。(C) 细胞类型注释结果。(D)、(E) 各样品和各组细胞型占比。(F) ndGBM组与rGBM组各细胞类型差异的卡方检验结果。蓝色和红色列表示各组中显著的细胞数，灰色列表示不显著的细胞数。(G) 每种细胞类型的标记基因热图。点的颜色代表表达水平。

Figure 1. Overall scRNA-seq process and results for the whole glioblastoma tissue

图1. 整个胶质母细胞瘤组织的scRNA-seq过程和结果

每个样本以及两组中每种细胞类型的比例如图2(D)和图2(E)所示，可以看出ndGBM组中GC9亚型细胞所占比例最大，而rGBM组中GC2亚型是最常见的细胞。其次最常见的细胞亚型是ndGBM组的GC2和rGBM组的GC6。ndGBM中无GC1，rGBM中无GC7。此外，可以观察到只有GC2在各个样本中均存在，故可以选择GC2作为潜在的目标胶质瘤细胞来探讨本文中ndGBM与rGBM的区别。此外，从图2(F)可以看出，两组间GC2的细胞数差异最小。图2(C)为散点图所示的GC2标记基因结果。

(A) (B) (C) (D) (E) (F) (G)(A) R包Seurat聚类生成的结果。(B) 细胞类型注释结果。(C) GC2特异性标记基因散点图。(D)、(E) 各样品和各组细胞型占比。(F) ndGBM组与rGBM组各细胞类型差异的卡方检验结果。蓝色和红色列分别表示各组中显著的细胞数，灰色列表示不显著的细胞数。(G) 每种细胞类型的标记基因热图。点的颜色代表表达水平。

Figure 2. Overall scRNA-seq process and results for glioma cells

图2. 胶质瘤细胞的scRNA-seq整体过程和结果

3.2. 拟时序分析

胶质瘤细胞的拟时序分析结果如图3所示。本研究将GC7定位起点，因为纳入数据集的作者将其识别为神经祖细胞样细胞 [20] 。而GC2分布在整个拟时序轨迹上(图3(A))。此外，可以观察到ndGBM组占据了起始阶段，这也支持了起始点的正确位置(图3(B))。每种胶质瘤细胞亚型在拟时序分化过程中标记基因的表达水平如图3(D)所示。

3.3. 富集分析

GC2的GO和KEGG富集分析结果如图4(A)和图4(B)所示，结果显示GC2主要富集于血管生成、细胞运动、对损伤和激素的反应以及细胞死亡。

在图4(A)和图4(C)中，圆形代表生物过程(Biological Process, BP)，三角形代表细胞成分(Cellular Component, CC)，菱形代表分子功能(Molecular Function, MF)。图4(B)和图4(D)中，圆圈表示KEGG通路。这些形状的颜色代表每个条目的P值，而这些形状的大小代表每个条目中富集的基因数量。

3.4. 细胞–细胞相互作用

胶质瘤细胞的细胞间相互作用结果如图5所示，结果表明，除了GC6与其他细胞外，几乎所有类型的细胞都在PTN-PTPRZ1通路中存在着较强的相互作用(图5(B))。热图显示，GC5为发送者，GC7则作为接收者和中介者，而GC3和GC4作为影响者(图5(C))。

3.5. SCENIC

每种胶质瘤细胞类型的排名靠前的TFs如图6(A)所示。本研究根据气泡图和散点图的特异性总结出GC2的特异性TFs，峰峦图和小提琴图显示了其表达水平，结果显示，MAFB、MEF2C、PRDM1和JDP2是GC2的特异性TFs。GC2的特定TFs的部分模序见图6(D)至图6(G)。本研究将这些TFs的潜在基因靶点构建成PPI网络(图6(C))。明显差异表达的TFs如图6(B)所示，结果显示RBM3在ndGBM组中表达更高，而YY1在rGBM组中表达更高。

(A) (B) (C) (D)(A) R包monocle推算的每种细胞类型的轨迹分析。(B) 每个组的轨迹分析。(C) 整个发展轨迹线的分析。每个点的颜色代表发展的顺序。(D) 各细胞类型中代表性标记基因的轨迹分析。分为三组，分别代表开始、中期和结束阶段。轨迹顺序为矩形从左到右，不同的颜色代表不同的表达水平。

Figure 3. Pseudotime analysis results

图3. 拟时序分析结果

(A) (B) (C) (D)(A)、(B)为GC2的富集结果。(C)和(D)为GC3的富集结果。

Figure 4. GO and KEGG pathway enrichment analysis results

图4. GO和KEGG途径富集分析结果

(A) (B) (C)(A) 细胞间通讯的相互作用强度。圆圈的大小表示细胞类型的数量，线条的宽度表示相互作用的强度。(B) 不同细胞类型间PTN通路相互作用的可能性。圆圈的大小代表p值，圆圈的颜色代表相互作用的可能性。(C) 每种细胞类型在通路中不同作用的热图。矩形的颜色表示细胞为该角色的概率。

Figure 5. Results of the cell-cell interaction analysis among cell types

图5. 细胞类型间细胞–细胞相互作用分析结果

(A) 每种细胞类型TF的活性点图。圆点的大小表示特异性调节子的评分，圆点的颜色表示TF的Z评分。(B) 所有评分TF的差异表达水平热图。(C) TF与其靶基因之间的PPI网络。(D)至(F) 由SCENIC确定的特异性TF。从左至右依次为GC2特异性TF的AUC直方图、散点图、峰峦图和小提琴图、特异性TF的代表性模序。

Figure 6. SCENIC results

图6. SCENIC结果

3.6. 关键基因的确定及GC2在两组中功能的差别

GC2在两组之间中的DEGs见补充表S3。本研究对其进行GO和KEGG富集分析(图7(A)、图7(B)、图7(D)、图7(E))和PPI网络分析(图7(C)、图7(F))，结果表明ndGBM组中上调的DEGs主要富集于细胞发育和PI3K-Akt通路。相比之下，rGBM组上调的DEGs主要富集于核苷代谢、细胞死亡，以及HIF-1通路。本研究根据CYTOSCAPE的12种算法对关键基因进行了鉴定。ndGBM组的关键基因为TUBB3、EGFR、APOE、PTPRZ1、NES、FABP7、SLC1A3，rGBM组的关键基因为JUN、CYR61、EGR1、FN1、SPP1、POSTN、CDKN2A、SOD2。

图7(A)、图7(B)、图7(D)、图7(E). ndGBM(A、B)和rGBM(D、E)中GC2的DEGs的GO和KEGG富集分析结果。图7(A)和图7(D)中，圆形代表生物过程(Biological Process, BP)，三角形代表细胞成分(Cellular Component, CC)，菱形代表分子功能(Molecular Function, MF)。在图7(B)和图7(E)中，圆圈表示KEGG通路。这些形状的颜色代表每个条目的p值，而这些形状的大小代表每个条目中富集的基因数量。GO项周围的空心矩形的颜色代表不同的功能领域。

图7(C)和图7(F) ndGBM组和rGBM组之间DEGs的PPI网络(C为ndGBM组，D为rGBM组)，关键基因用红色标记。

4. 讨论

靶向治疗胶质母细胞瘤的一个明显困难是胶质母细胞瘤的异质性，因为肿瘤细胞的类型如此之大，可能对不同类型的放疗和传统化疗产生耐药性 [21] 。在本文中，我们筛选了一种可能存在于每个胶质母细胞瘤样本中的胶质瘤亚型GC2，且ndGBM和rGBM中GC2的数量差异最小。此外，它似乎存在于细胞发育的每个阶段，因此，靶向该亚型可能对几种类型的胶质母细胞瘤有益。

(A) (B) (C) (D) (E) (F)

Figure 7. Differences between the ndGBM and rGBM groups

图7. ndGBM组与rGBM组的差异

GC2被证实为间充质样细胞和星形胶质细胞样细胞，并且与上皮–间充质转化和缺氧有关 [20] ，因此，针对这种肿瘤细胞类型可能有效治疗胶质母细胞瘤。在本文中，GO和KEGG条目如细胞运动、氧化磷酸化、活性氧等都与这些特性有关。本文确定GFAP是GC2的特异性较高的标记基因。研究发现GFAP是胶质瘤的诊断和预后标志物 [22] [23] ，GFAP水平越高，诊断的准确率越高，预后结果越差，这支持了我们的研究结果，即GFAP可能在胶质瘤患者中持续存在，靶向GFAP可能有助于胶质母细胞瘤的治疗。在拟时序分析的热图中，可以观察到GFAP位于晚期，这可能表明GFAP作为胶质母细胞瘤诊断标志物的局限性。

最近的一项研究表明，抑制PTN-PTPRZ1通路可促进胶质瘤微环境的重塑，有利于提高胶质瘤的治疗效果，延长小鼠胶质母细胞瘤的生存期(由33.5天延长至46天) [24] 。我们的细胞–细胞相互作用结果表明，GC2参与了这一通路，这表明靶向GC2可能有助于提高治疗效果。SCENIC的结果确定了GC2的四种特异性TFs。根据已发表的研究，PRDM1与胶质瘤干细胞的活性相关 [25] ，这与GC2的特征相关。然而，从热图、AUC直方图、峰峦图和小提琴图来看，GC2的四种特异性TFs的表达水平都不够明显。此外，我们发现YY1在rGBM组中表达水平较高。有研究表明，YY1在促进胶质瘤干细胞自我更新中发挥重要作用 [26] ，并与放疗耐受和复发有关 [27] ，这与我们的研究结果相一致。一项研究表明RBM3是诊断胶质瘤的潜在标志物 [28] ，我们的研究结果进一步预测RBM3可能仅是ndGBM的诊断标志物。

两组间GC2功能不同的表明GC2在胶质瘤不同阶段可能具有明显不同的功能。事实上，已经有研究证实PD-1 (程序性死亡-1)与PD配体之间的相互作用在胶质瘤的侵袭中起着重要作用 [26] 。我们的研究结果表明，针对rGBM细胞死亡相关途径的治疗可能比ndGBM相对更有效。此外，可以推测ngGBM中的GC2可能更类似于胶质组织，因为它的GO条目相对更接近正常组织。本研究分别从ndGBM和rGBM鉴定出了7个和8个关键基因。TUBB3和FABP7是细胞发育分化的经典细胞标志物 [29] [30] [31] ，这与ndGBM中GC2的功能相一致。根据纳入数据集的作者提供的信息 [20] ，我们的研究发现的关键基因EGFR在一个ndGBM样本中发生了突变。研究表明，EGFR可促进胶质瘤细胞的发生并与其预后不良有关 [32] [33] 。研究发现，约有50%的ndGBM患者EGFR表达量升高，与本研究结果较一致 [34] 。有趣的是，PTPRZ1被鉴定为ndGBM组的关键基因，这可能表明PTN-PTPRZ1通路在ndGBM中具有相对活跃的作用。

通过比较各种细胞的细胞数量可以看出，ndGBM拥有更多的B细胞和T细胞，而rGBM拥有更多的髓系细胞。这一结果提示两组患者可能存在不同的免疫微环境，这可能是未来治疗的靶点。此外，尽管GC1、GC3、GC7和GC9仅存在于ndGBM或rGBM中，但只有GC3可视为rGBM特异性胶质瘤细胞亚群，其他三种细胞类型不能视为ndGBM或rGBM特异性，因为这三种细胞类型大多只存在于个别样本中。因此，靶向GC3也可能是治疗rGBM的一种治疗方法。我们进行的GO富集分析(图4(C)和图4(D))也证实了GC3是一种增生性细胞类型 [20] ，这与GC2在rGBM中的功能不同，可能提示其在rGBM的进展中具有潜在的关键作用。由于GC8在纳入的样本中数量较少(根据原作者的注释结果 [20] ，只有5个细胞)，这可能是本文没有筛选到GC8的原因。

据我们所知，本研究首次通过scRNA-seq寻找一种固定的存在于胶质母细胞瘤的胶质瘤细胞亚型并比较其在ndGBM和rGBM之间的差异，因此，本研究不可避免地存在一些局限性。首先，在大批量测序的今天，本研究纳入的胶质瘤细胞的数量较少。其次，由于纳入样本的临床病理特点，本研究结果的适用范围可能较小。第三，我们文章中鉴定的几个基因在未来的研究中仍需要验证，靶向关键基因的药物也需要探索。

5. 结论

总之，我们的文章筛选了WHO IV级、IDH野生型和甲基化胶质母细胞瘤中存在于每个样本和每个发展阶段的一类胶质瘤细胞亚型。介绍了其可能的功能、细胞相互作用、特异性TFs。此外，还鉴定了其在ndGBM和rGBM组之间的不同功能，并最终确定了两组的关键基因。进一步的研究需要通过分子实验来验证所得到的基因，并针对这些靶点开发诊断方法和药物治疗ndGBM和rGBM。

基金项目

国家自然科学基金21604045，81671305，81470059；山东省自然科学基金ZR2022MH022；青岛市自然科学基金4148。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。