基于头孢曲松钠–牛血清白蛋白相互作用机制的药物协同性研究

Study on Drug Synergy Based on the Interaction Mechanism between Ceftriaxone Sodium and Bovine Serum Albumin

摘要: 本文采用荧光和同步荧光光谱法，基于头孢曲松钠(CRO)–牛血清白蛋白(BSA)相互作用机制研究药物协同性和CRO蛋白结合率及BSA中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基的药物结合率。结果表明：CRO与BSA结合使BSA中Tyr和Trp残基的荧光发生静态荧光猝灭，且均参与体系结合反应。N_{SFQ (Tyr)} > N_{SFQ (Trp)}，结合位置更靠近Tyr残基，结合位点数n ≈ 1，ΔG < 0，ΔH > 0，ΔS > 0，体系环境以疏水作用为主；模拟生理条件下，Hill系数n_H ≈ 1，当4.08 mg/L < c_CRO < 8.16 mg/L时，CRO-BSA中Tyr残基的药物结合率W(Q)为6.5%~12.6%，Trp残基的药物结合率W(Q)为6.35%~12.07%，Tyr和Trp残基的药物结合对CRO的药效基本没有影响，CRO的蛋白结合率可达95%以上。

Abstract: In this paper, we used fluorescence and synchronous fluorescence spectroscopy to study drug synergism and CRO protein binding and drug binding of tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) residues in BSA based on the mechanism of ceftriaxone sodium (CRO)-bovine serum albumin (BSA) interaction. The results showed that CRO binding to BSA caused static fluorescence burst of Tyr and Trp residues in BSA, and both were involved in the system binding reaction. N_{SFQ (Tyr)} > N_{SFQ (Trp)}, the binding position was closer to the Tyr residue, the number of binding sites n ≈ 1, ΔG < 0, ΔH > 0, ΔS > 0, and the system environment was predominantly hydrophobic; under simulated physiological conditions, the Hill coefficient n_H ≈ 1, when 4.08 mg/L < c_CRO < 8.16 mg/L, the drug binding rate W(Q) of Tyr residues in CRO-BSA was 6.5%~12.6%, and that of Trp residues was 6.35%~12.07%, and the drug binding of Tyr and Trp residues was basically unaffected by the drug efficacy of CRO. The protein binding rate of CRO could reach more than 95%.

1. 引言

近年来，药物小分子与生物大分子相互作用机理的研究方法主要有紫外可见 [1] 、电化学、圆二色谱 [2] 及荧光光谱法 [3] 等，其中以荧光和同步光谱法作为重要的研究手段，因其具有选择性好，灵敏度高等特点，受到研究者的青睐，同时相关研究结果已持续报道。

头孢曲松钠作为临床常用的第三代头孢菌素，属于β-内酰胺类抗生素，主要用于预防和治疗呼吸道感染、泌尿感染等 [4] 。近年来，采用光谱法对头孢曲松钠与生物大分子的相互作用鲜有报道 [5] ，但是对头孢曲松钠与蛋白结合位置、蛋白中酪氨酸，色氨酸残基结合情况及药物协同性等方面的研究未见报道，因此本实验采用荧光和同步荧光光谱，在不同激发波长下，基于头孢曲松钠(CRO)–牛血清白蛋白(BSA)相互作用机制研究体系的药物协同性和CRO的蛋白结合率及BSA中酪氨酸(Tyr)残基和色氨酸(Trp)残基的药物结合率，对深入分析药物动力学和为临床用药提供参考具有一定意义和应用价值。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

仪器：荧光分光光度仪(Agilent Cary eclipse，Germany)，pH计(PHS-25，上海)。

试剂：牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)，头孢曲松钠(CRO，Sigma公司，纯度 ≥ 98%)，其余试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

2.2. 实验方法

头孢曲松钠储备液的配制：准确称量10.2 mg，定容为100 mL，浓度为0.102 g/L；牛血清白蛋白储备液的配制：用pH = 7.38的Tris-HCl缓冲溶液定容，使其浓度为0.682 mg/mL，置于冰箱冷藏保存。

在25 mL比色管中依次加入2.00 mL BSA、5.00 mL 0.5mol/LNaCl溶液，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL的头孢曲松钠溶液，用pH = 7.38的Tris-HCl缓冲溶液定容。荧光比色皿为1 cm，入射和出射狭缝均为5 nm，在310 K，298 K，290 K下扫描体系的荧光光谱和同步荧光光谱。

3. 结果与讨论

3.1. CRO-BSA的荧光猝灭机制

蛋白质呈现出荧光效应是因色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)残基发色团共同作用 [3] 。Phe激发的荧光强度与前两者相比很小，因此，λ_ex = 280 nm时可激发Trp和Tyr的荧光，λ_ex = 295 nm只有Trp荧光被激发。

设置λ_ex = 280 nm和λ_ex = 295 nm时，对CRO-BSA体系进行荧光光谱测定，见图1。

Figure 1. Fluorescence spectra of CRO-BSA (T = 310 K, a: λ_ex = 280 nm; b: λ_ex = 295 nm, c_BSA = 8.21 × 10⁻⁷ mol/L; 0~10 c_CRO = (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶ mol/L)

图1. CRO-BSA体系的荧光光谱(T = 310 K，a: λ_ex = 280 nm；b: λ_ex = 295 nm，c_BSA = 8.21 × 10⁻⁷ mol/L；0~10 c_CRO = (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶ mol/L)

Figure 2. Stern-Volmer plots for the quenching of CRO-BSA at different temperatures (a: λ_ex = 280 nm; b: λ_ex = 295 nm)

图2. 不同温度下CRO-BSA体系的Stern-Volmer曲线(a: λ_ex = 280 nm；b: λ_ex = 295 nm)

从图1可以看出，CRO的浓度从0~10浓度逐渐增大，BSA的荧光强度不断减低，表明CRO的加入，使BSA荧光猝灭，和BSA发生相互作用。

为进一步研究体系的相互作用机制，根据Stern-Volmer方程 [6] ：

$\frac{F_0}{F}=1+K_{sv}{c}_q=1+K_q\tau c_q$ (1)

式中F、F₀分别为有、无猝灭剂时的荧光强度；K_sv为动态猝灭常数(即Stern-Volmer猝灭常数)；c_q为猝灭剂的浓度；K_q为荧光猝灭速率常数，各类猝灭剂对生物大分子K_q一般为2.0 × 10¹⁰ L∙mol⁻¹∙s⁻¹；τ₀：生物分子荧光平均寿命，一般为10⁻⁸ s [7] 。

以F₀/F对c_q作图，得到不同温度下的K_sv和K_q，见图2。

根据不同温度下CRO-BSA体系Stern-Volmer方程，得到λ_ex = 280 nm，λ_ex = 295 nm时K_q和K_sv，见表1。

Table 1. Quenching reactive parameters of CRO-BSA at different temperatures

表1. CRO-BSA体系的荧光猝灭反应参数

n是CRO-BSA的结合位点数；r₁是方程F₀/F~c_q的线性相关系数；r₂是方程log(F₀-F)/F~lgc_q的线性相关系数。

表1数据表明，不同温度下，λ_ex = 280 nm和λ_ex = 295 nm的K_q > 2.0 × 10¹⁰ L·mol⁻¹·s⁻¹，表明CRO的加入使BSA发生了静态猝灭，同时，随着温度升高，K_sv略有减小，不同激发波长下的变化趋势一致，表明CRO-BSA形成基态复合物，发生静态猝灭 [8] ，两者结论一致。

根据CRO-BSA的荧光猝灭反应过程为静态猝灭，同时运用下述公式(2)计算求出结合位点数n以及结合常数K_a。

$\lg \left(F_0-F\right)/F=\lg K_a+n\lg c_q$ (2)

不同温度下，λ_ex = 280 nm和λ_ex = 295 nm时，以log(F₀ − F)/F~lgc_q作图，得到图3。

Figure 3. log(F₀ − F)/F~lgc_q plots for the quenching of CRO-BSA at different temperatures (a: λ_ex = 280 nm b: λ_ex = 295 nm)

图3. 不同温度下CRO-BSA体系log(F₀ − F)/F~lgc_q曲线(a: λ_ex = 280 nm b: λ_ex = 295 nm)

从图3拟合曲线方程得到结合位点数n ≈ 1，说明CRO与BSA只有一个结合位点；表1中的数据表明，相同温度下λ_ex = 280 nm和λ_ex = 295 nm的K_a不同，且有一定的差异，λ_ex = 295 nm的K_a大于λ_ex = 280 nm的K_a，但是K_a随温度的变化趋势一致，随着温度增加，K_a略有降低，表示CRO-BSA配合物稳定性略有下降，同时诠释了体系的荧光猝灭为静态猝灭 [9] 。

3.2. CRO-BSA结合位置的确定

图4为不同温度下，λ_ex = 280 nm和λ_ex = 295 nm时，随着CRO浓度逐渐增大，BSA的荧光猝灭曲线。

Figure 4. Quenching curves of CRO-BSA system at λ_ex = 280 nm and 295 nm (a = 298 K; b = 310 K)

图4. λ_ex为280 nm、295 nm时CRO-BSA体系的荧光猝灭曲线(a = 298 K；b = 310 K)

从图4中可以看出，在不同温度下，当λ_ex = 280 nm或λ_ex = 295 nm时，体系的荧光猝灭曲线并未重合，说明在CRO-BSA的反应中，Tyr和Trp都有参与，因小分子在BSA中主要结合位置是IIA和IIIA的疏水腔中 [10] ，对于CRO-BSA体系而言，CRO主要在BSA的亚结构IIA位置结合。

3.3. CRO-BSA体系的同步荧光光谱

Figure 5. Synchronous fluorescence spectra of CRO-BSA system (T = 310 K, a: Δλ = 15 nm; b: Δλ = 60 nm, C_BSA = 8.21 × 10⁻⁷ mol/L; 0~10 C_CRO = (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶ mol/L)

图5. CRO-BSA体系的同步荧光光谱(T = 310 K，a: Δλ = 15 nm；b: Δλ = 60 nm，C_BSA = 8.21 × 10⁻⁷ mol/L；0~10 c_CRO = (0, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶ mol/L)

Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm分别表示BSA中Tyr残基和Trp残基的光谱特征 [11] ，若同步荧光的λ_max发生位移，表明基团分子极性发生变化 [12] 。图5为310 K时Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm时CRO-BSA体系的同步荧光光谱。

从图5看出，CRO-BSA体系的同步荧光光谱随着CRO浓度逐渐增大，BSA中的Tyr和Trp残基均出现明显的同步荧光猝灭，表明BSA中的Tyr和Trp残基参与了CRO与BSA的结合作用，但是最大吸收波长几乎没有发生位移，说明Tyr和Trp残基周围的微环境没有发生改变。

根据公式(1)和(2)，计算得到CRO-BSA体系的同步荧光猝灭反应参数，见表2。

Table 2. Synchronous fluorescence quenching parameters of CRO and BSA at different temperatures

表2. CRO-BSA体系的同步荧光猝灭反应参数

表2中数据表明，不同温度下，Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm的K_q > 2.0 × 10¹⁰ L∙mol⁻¹∙s⁻¹，表明CRO与BSA相互作用发生了静态猝灭；同时，温度升高，K_sv略有减小，这一结论与CRO-BSA体系荧光猝灭反应参数呈现的结论一致，表明CRO-BSA形成基态复合物，发生静态猝灭，同时结合位点数≈1，荧光和同步荧光结论一致。

荧光猝灭比率R_SFQ [13] (R_SFQ = (F₀-F)/F₀)和荧光猝灭比例分数N_SFQ [14] (N_{SFQ (Tyr)} = R_{SFQ (Tyr)}/(R_{SFQ (Tyr)} + R_{SFQ (Trp)}，N_{SFQ (Trp)} = 1 − N_{SFQ (Tyr)})可进一步表示BSA中Tyr和Trp残基参与体系结合情况。当T = 310 K，C_BSA = 8.21 × 10⁻⁷ mol/L，C_CRO = (0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20, 1.40, 1.60, 1.80, 2.00) × 6.16 × 10⁻⁶ mol/L时，N_{SFQ (Tyr)}分别为61.79%、59.33%、58.17%、55.82%、56.21%、55.61%、55.28%、54.95%、54.11%、54.28%，平均值为56.55%；N_{SFQ (Trp)}分别为38.21%、40.67%、41.83%、44.18%、43.79%、44.39%、44.72%、45.05%、45.89%、45.72%，平均值为43.45%，结果表明BSA中Tyr和Trp残基均参与体系结合反应，与上述CRO-BSA结合位置的结论一致，且N_{SFQ (Tyr)} > N_{SFQ (Trp)}，说明体系结合反应更靠近Tyr残基，与表2中结合常数K_a数据结论一致。

3.4. CRO-BSA体系的作用力类型

当T变化不大时，根据Vant’s Hoff方程(公式3)和热力学方程(公式4)，可计算CRO-BSA体系的热力学参数，结果见表3。

$R\ln K=\Delta S-\Delta H/T$ (3)

$\Delta G=\Delta H-T\Delta S$ (4)

温度变化不大时，ΔH基本不变化，以RlnK与1/T作图，ΔH即可由不同温度下CRO-BSA体系的Vant's-Hoff线性关系图得到，见图6。从图中可以看出λ_ex = 280 nm，λ_ex = 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，RlnK与1/T呈现良好的线性关系，r分别为0.9837，0.9998，0.9909和0.9994。

Table 3. Thermodynamic parameters of CRO-BSA system at different temperatures

表3. 不同温度下CRO-BSA体系的热力学参数

Figure 6. Vant’s-Hoff plot for the interaction of BSA and CRO at different temperatures (a: λ_ex = 280 nm; b: λ_ex = 295 nm; c: Δλ = 15 nm；d: Δλ = 60 nm)

图6. 不同温度下CRO-BSA体系的Vant’s-Hoff曲线(a: λ_ex = 280 nm；b: λ_ex = 295 nm；c: Δλ = 15 nm；d: Δλ = 60 nm)

从表3可以看出，λ_ex = 280 nm，λ_ex = 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，计算所得热力学参数略有差异，相同温度下，λ_ex = 280 nm的ΔG小于λ_ex = 295 nm，Δλ = 15 nm的ΔG小于Δλ = 60 nm，进一步表明CRO与BSA中Tyr残基结合趋势更强，且反应自发进行；ΔH > 0表明CRO与BSA结合为吸热过程；ΔS > 0表明体系环境中水分子以有序的方式围绕体系，因ΔG < 0，ΔH > 0，ΔS > 0，由此可判断CRO与BSA结合的作用力是以疏水作用为主，静电引力为辅 [15] 。

3.5. 药物协同性及体系的结合率

药物协同性可以用Hill方程的系数n_H进行定量分析，Hill方程 [16] (5)：

$\lg \left(\frac{Y}{1-Y}\right)=\lg K_a+n_H\lg \left[L\right]$ (5)

Y为结合饱和分数；n_H为Hill系数；同时根据实验中公式(6)，(7)

$Y/\left(\text{1}-Y\right)=Q/\left(Q_m-Q\right)$ (6)

$Q=\text{1}-F/F_0$ (7)

1/Q对1/[L]作图得到1/Q_m，n_H由lg[Y/(1-Y)]对lg[L]作图得到，结果见表4。

Table 4. Hill coefficient of CRO-BSA at different temperatures

表4. 不同温度下CRO-BSA的Hill系数

从表4中数据表明，在不同温度下，λ_ex = 280 nm，λ_ex = 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时的n_H ≈ 1，因n_H > 1表现为正协同作用，n_H < 1为负协同作用，n_H = 1没有协同作用 [17] ，所以，在CRO与BSA结合过程中没有协同作用，不影响后继配体与BSA的结合。

CRO-BSA的结合率可以根据同步荧光所得K_a值，结合位数n = 1，根据公式(8)、(9)分别计算CRO与BSA中Tyr和Trp残基的药物结合率和CRO蛋白结合率 [18] 。

药物结合率： $W\left(Q\right)=\frac{K_a\left(Q+B\right)+1-\sqrt{K_{{}_a}^2{\left(Q-B\right)}^2+2K_a\left(Q+B\right)+1}}{2K_{a}Q}\times 100\%$ (8)

蛋白结合率： $W\left(B\right)=\frac{K_a\left(Q+B\right)+1-\sqrt{K_{{}_a}^2{\left(Q-B\right)}^2+2K_a\left(Q+B\right)+1}}{2K_{a}B}\times 100\%$ (9)

式中Q和B分别代表CRO和BSA的总浓度。

CRO为常见的临床注射用头孢类抗生素，本实验以头孢曲松钠注射用无菌粉末为例，模拟人体体温310 K时，当4 mg/L < c_CRO < 8 mg/L时，计算得到CRO-BSA中Tyr残基的药物结合率W(Q)为6.5%~12.6%，药物游离率为93.5%~87.4%，Trp残基的药物结合率W(Q)为6.35%~12.07%，药物游离率为93.65%~87.93%，由此可见，Tyr和Trp残基的药物结合率W(Q)与游离的药物浓度变化不大，说明体系中Tyr和Trp残基的结合对CRO的药效基本没有影响。

随着CRO浓度增大，4.08 mg/L < c_CRO < 8.16 mg/L时，CRO在Tyr残基的蛋白结合率W(B)为94.6%~97.4%，蛋白游离率为5.4%~2.6%，在Trp残基的蛋白结合率W(B)为90.71%~95.41%，蛋白游离率为9.29%~4.59%。结果表明：CRO与BSA结合后，游离的Tyr和Trp残基蛋白数量明显减少，CRO蛋白结合率可达95%以上，这与静脉滴注CRO (c_CRO < 25 mg/L)的蛋白结合率95% [19] 基本一致，数据表明，当CRO进入人体后，立即与血液中蛋白结合，会使血浆蛋白中游离的Tyr残基和Trp残基数量大大减少，CRO在血液中可以被充分的转运，能持续释放，药物浓度较稳定，因此CRO在人体内不会被代谢，主要以原形自消化系统和泌尿系统排出。

4. 结论

本实验在模拟生物条件下，采用荧光光谱和同步荧光光谱，λ_ex = 280 nm，λ_ex = 295 nm，Δλ = 15 nm及Δλ = 60 nm时，研究了不同温度下CRO-BSA体系相互作用机理，基于体系的作用机理，进一步探索了CRO-BSA体系的药物协同性和CRO的蛋白结合率及BSA中Tyr和Trp残基的药物结合率，通过蛋白质中游离Tyr和Trp残基含量的变化，分析药物分子在人体代谢方式，本方法对研究药物与蛋白质残基结合的作用机理具有一定的意义，为进一步研究药物在临床应用提供参考。

基金项目

贵州师范学院大学生科研项目(No：2023DXS018)，大学生创新训练项目(No：2023142234029, S2023142234094)。

NOTES

^*通讯作者。