贵州黎平地区沼水蛙的分子鉴定

Molecular Identification of a Sylvirana guentheri Population Distributed in Liping County, Guizhou Province in China

摘要: 于2015年8月在贵州省黔东南州黎平县德凤镇南泉山采集到2个蛙类标本，经初步形态鉴定为沼水蛙(Sylvirana guentheri)，但之前并没有该物种在黎平县分布的文献记载，因此有必要使用分子手段对其分类地位进行准确界定。本文对采自贵州黎平县的沼水蛙标本进行DNA提取，并克隆其线粒体16S rRNA基因片段，使用分子系统发育学研究方法对其物种进行初步的分子鉴定。结果表明，黎平采蛙类样本16S rRNA基因序列与31条沼水蛙同源序列聚为一个支持率较高的单系，支系内序列间平均遗传距离为0.0056，且对应序列单倍型均在同一个单倍型网络内。自测序列与沼水蛙近模式产地(福建福州)一标本的16S rRNA基因序列遗传距离较小。因此，初步判断该标本属沼水蛙(Sylvirana guentheri)。初步的种群中性检验分析表明，沼水蛙种群最近可能发生过种群扩张。另外，本文探讨了较短的同源序列对相关系统发育分析结果的影响。

Abstract: In August 2015, two frogspecimens were collected from Nanquan Mountain of Defeng Township, Liping County, Qiandongnan Prefecture in Guizhou Province. They were identified as Sylvirana guentheri by preliminary morphological identification. However, it was not documented the distribution of this species in Liping County, so it is necessary to use molecular means to accurately define their taxonomic status. In this paper, DNA extraction and cloning of mitochondrial 16S rRNA gene fragment of Sylvirana guentheri from Liping County, Guizhou Province were carried out. The preliminary molecular identification of this population was carried out by using the research method of molecular phylogeny. The results showed that the 16S rRNA gene sequences of Liping frogs and the homologous sequences of 31 Sylvirana guentheri frogs were clustered into a monophyletic clade with high support rates. The average genetic distance between sequences in the branch was 0.0056, and the corresponding haplotypes were all in the same haplotype network. The genetic distance between the 16S rRNA gene sequence of Liping frogs and the homologous sequence of a sample collected near type localitiy (Fuzhou, Fujian) was 0.008. Therefore, it is preliminarily determined that this specimen belongs to Sylvirana guentheri. The neutrality tests of S. guentheri population showed that the population may have expanded recently in history. In addition, the influence of shorter homologous sequences on the results of related phylogenetic analysis was discussed.

1. 引言

沼水蛙(Sylvirana guentheri)属无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)，新种描述时，2个模式标本采自“Amoy”、1个模式标本采自“China” [1] ，后来进一步明确模式产地为厦门(“Amoy”) [2] ，归属广义蛙属(Rana guentheri Boulenger, 1882)。之后，沼水蛙的分类地位及归属一直是两栖动物分类学的热点问题之一，先后经历蛙属水蛙亚属Rana (Hylorana) guentheri [3] 、水蛙属Hylarana guentheri [4] 、水蛙属水蛙亚属Hylarana (Hylarana) guentheri [5] 、蛙属肱腺蛙亚属Rana (Sylvirana) guentheri [6] 、水蛙属肱腺蛙亚属Hylarana (Sylvirana) guentheri [7] 的多次改隶。2012年，费梁等将沼水蛙单独归为沼蛙属Boulengerana guentheri [8] 。最新基于线粒体基因、核基因及形态特征的整合系统发育将沼水蛙确定归属为肱腺蛙属Sylvirana guentheri [9] 。

沼水蛙主要分布在我国北纬31˚以南各省(区) [7] ，在越南、老挝也有分布 [7] 。据记载，沼水蛙在贵州主要分布在东部和南部地区，例如黔东南(雷山、榕江、雷山)、铜仁(印江、德江、江口、松桃)，遵义(仁怀、桐梓、绥阳、赤水)、黔南(贵定、荔波、罗甸、三都)及黔西南(望谟)等 [7] ，贵阳和毕节(毕节、大方、金沙)也有分布记载 [7] ，然而，至今仍然没有黎平地区是否有沼水蛙分布文献记载。另外，有关贵州地区沼水蛙的研究报道，多基于形态学研究，基于分子标记的系统发育研究相对较少 [10] 。熊荣川等 [11] 基于线粒体COI基因，专题研究了贵州高原分布沼水蛙的系统发育地位，发现贵州高原对于沼水蛙内部种群分化有明显的隔离作用，暗示在贵州地区开展基于分子标记的沼水蛙系统发育学研究，具有一定的理论意义。

本研究于2015年8月在贵州省黔东南州黎平县德凤镇南泉山采集到2个蛙类标本，经初步形态鉴定为沼水蛙(Sylvirana guentheri)，但之前并没有该物种在黎平地区分布的文献记载，因此有必要使用分子手段对其分类地位进行准确界定。本文对采自贵州黎平县的沼水蛙标本进行DNA提取，并克隆其线粒体16S rRNA基因片段(以下简称16S序列)，使用分子系统发育学研究方法对其物种进行初步的分子鉴定。

2. 材料与方法

2.1. 标本信息

沼水蛙(Sylvirana guentheri)标本为2015年8月采自贵州省黔东南州黎平县德凤镇南泉山的2号标本(LPSLP2015081906, LPSLP2015081705)，保存于六盘水师范学院动物标本馆。

2.2. 总DNA提取及目的基因片段的扩增

分子样品制备、DNA提取及目的基因片段的PCR扩增方法参照本课题组之前的研究 [12] 。所扩增目的序列对应沼水蛙(Sylvirana guentheri)线粒体基因组(Genbank索取号MN248533) 2151~2696 bp区间位置，对应阔褶水蛙16S rRNA全基因(Genbank索取号MN241431) 874~1419 bp区间位置。

2.3. 参考基因序列下载及数据集构建

本研究使用标本的16S序列与Genbank中相关参考序列合并为数据集，构建系统发育树，分析自测序列与已知序列的系统发育关系对其物种归属进行分子鉴定。首先，将所测得的2条沼水蛙16S基因序列经过上传GenBank进行搜索比对(megablast)，各下载Genbank中的100条参考序列，经过序列号去重，得到101条初始参考数列，与2条自测序列一起构成数据集A1。根据双重单系法 [13] ，筛选出与自测序列亲缘关系较近的同源基因序列，构成数据集B1；其中第一重单系内序列构成数据集C1用于后续种群遗传学分析。

Genbank中下载的同源序列中KR827771、KR827772、KR827773长度较短，相较其它540 bp左右的同源序列，短约26%~28%，为探究类似较短同源序列对系统发育分析结果的影响，分别在数据集A1、B1、C1中删除以上3条序列，构成对应的数据集A2、B2、C2。

2.4. 系统发育分析

进行系统发育分析时，不预先设定外群，构建一棵无根系统发育树。用集成于MEGAX [14] 中的MUSCLE程序对序列进行比对，辅以人工校对，修剪不整齐的片段部分。使用MEGA软件构建最大简约树(Maximum Parsimony Tree, MP tree)，以及基于p-distance方法构建显示支系长度的邻接树(Neighbor-Joining Tree, NJ tree)；在Phylosuite软件包 [15] 中，使用ModelFinder [16] 筛选适合该数据集序列演化的最优模型以供IQ-TREE [17] 和MrBayes [18] 两个软件进行最大似然法分析和贝叶斯分析。使用Mrbayes3.2构建贝叶斯树时，起始树设为随机树，马尔科夫链的蒙特卡洛方法设置为4条链同时运行1 × 107代，3条热链、1条冷链。每1000代对系统树进行抽样，当分离频率平均标准差值(Average standard deviation of split frequencies)小于0.01时停止抽样。将前25%的系统发育树舍弃后，根据剩余的样本构建一致树(consensus tree)并计算相关参数。使用IQ-TREE构建ML树时，运行5000次超快自举检验(ultrafast bootstraping)估算结点支持率。

为探究较短同源序列对系统发育分析结果的影响，对比分析在数据集A1、B1、C1中删除3条短序列与删除前的系统发育树结构是否一致。同时，使用SPSS软件中的对照样本T检验方法，分析删除短序列前后的系统发育树中各关键节点支持率是否存在显著差异。

另外，使用R语言程序包haplotypes，分析数据集C的单倍型类型并绘制单倍型网络。

2.5. 种群动态分析

基于数据集C，使用R语言程序包haplotypes，分析单倍型类型并绘制单倍型网络。使用进行R语言程序包pegas [19] 绘制单倍型岐点分布图并进行R2中性检验(Ramos-Onsins-Rozas Test of Neutrality, R2 test)，利用DnaSP v5 [20] 软件对沼水蛙群体进行Tajima’sD和Fu’sFs中性检测。

2.6. 遗传距离计算

基于16S基因数据集，使用MEGAX软件计算序列间的遗传距离，模型设置为Kimura 2-parameter。基于具体序列的支系及物种归属对遗传距离进行分类。

3. 结果

3.1. PCR扩增及测序结果

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到550 bp左右的基因片段(GenBank索取号：LC705201- LC705202)。序列碱基组成存在明显的偏向性：AT含量较高(A: 29.82%, T: 24.68%)；GC含量较低(G: 20.55%, C: 24.95%)。

3.2. 支系分化

基于不同的系统发育分析方法(ML, BI, NJ, MP)对数据集A1构建的系统发育树中(图1)，自测序列与31条沼水蛙16S基因序列(表1)聚为一个支持率较高的单系N02 (表2)。该沼水蛙支系进一步与Humerana humeralis，Humerana miopus构成一个支持率较高的第二重单系N01。沼水蛙支系内部没有明显的支系分化。Humerana humeralis支系(N04)支持率较高，同时其内部进一步分化为两个支持率较高的支系(N05、N06)。数据集B1构建的系统发育树基本与A1一致(图1，表2)。数据集A2构建的系统发育树基本与A1一致；数据集B2构建的系统发育树基本与B1一致。使用SPSS软件中的对照样本T检验方法，分析删除短序列前后的系统发育树中各关键节点(图1, N01-N07)支持率差异性，发现删除短序列前后，各节点支持率没有显著变化(t = 1.75, df = 43, P < 0.087)。

Table 1. The sequence information of the dataset B in this study

表1. 本研究中数据集B的序列信息

3.3. 遗传距离

两条自测序列与近模式产地沼水蛙同源序列(KF185060)的遗传距离均为0.008。沼水蛙支系(N02)内部序列间平均遗传距离为0.0056 (0.0000~0.0171)，支系N05内部两条序列间遗传距离为0.0019，支系N06内部序列间平均遗传距离为0.0069 (0.0037~0.0100)。支系N02与N05间的平均遗传距离为0.0899 (0.0812~0.1207)，与N06间的平均遗传距离为0.0865 (0.0747~0.1197)，与N07间的平均遗传距离为0.0743 (0.0687~0.1019)。支系N05与N06间的平均遗传距离为0.0196 (0.0132~0.0248)，与N07间的平均遗传距离为0.0847 (0.0835~0.0859)。支系N06与N07间的平均遗传距离为0.0819 (0.0769~0.0857)。

3.4. 种群动态

数据集C1因为含有3条较短的同源序列(表1, KR827771-3)，无法使用R语言程序包haplotypes分析单倍型。基于去掉3条序列后数据集C2，分析得到17个单倍型，其单倍型网络(表1，图2)表明自测

Figure 1. The neighbor-joining tree based on the 16S dataset and the clade surport rates under different phylogenetical analysis

图1. 基于16S序列数据集构建的邻接树及相关支系在不同方法构建的系统发育树中的支持率

Table 2. The node support values for the phylogenetic trees in this study

表2. 本研究系统发育树中个节点支持率

序列在同一单倍型分支上，与越南同源序列(Hp16)关系最近。采自福建福州的近模式产地序列单倍型(Hp12)并非古老单倍型，与四川泸州种群关系较近。Hp10为一古老单倍型，向外发出8个分支，包含有越南、海南的5条同源序列。

单倍型歧点分布图呈不完整单峰型(图3)，数据集C1经中性检验Tajima’s D (−1.41883, P > 0.1)和Fu’s Fs D (−2.07012, 0.10 > P > 0.05)均为负值，但不显著，R2检验值为0.03805321 (P < 0.05)。数据集C2，经中性检验Tajima’s D (−1.52901, P > 0.1)和Fu’s Fs (−2.12379, 0.10 > P > 0.05)均为负值，但不显著，R2检验值为0.04185298 (P < 0.05)。数据集C1和C2的中性检验结果基本一直，虽然Tajima’s D和Fu’s Fs D值皆为负数，但不显著，即不支持沼水蛙种群在较近的历史上可能有种群扩张；R2检验则相反，表现出显著偏离中性假说，这种矛盾与单倍型歧点分布图不完整的单峰形态契合。考虑对于小样本种群，R2检验优于Fu’s Fs检验 [32] ，沼水蛙种群历史上可能有种群扩张。

Figure 2. The haplotype network based on the dataset C1. The numbers in the haplotypes means the number of the sequences under it

图2. 基于数据集C1构建的单倍型网络图。单倍型内数字，代表该单倍型所含有的序列数目

Figure 3. Mismatch distribution of the 16S haplotypes from the S. guentheri samples

图3. 沼水蛙16S序列单倍型岐点分布图

4. 讨论

4.1. 沼水蛙黎平种群的分子鉴定

本文使用分子系统发育学研究方法，对采自贵州黎平县的沼水蛙标本进行初步的分子鉴定。结果表明，黎平蛙类样本16S rRNA基因序列与31条沼水蛙同源序列聚为一个支持率较高的单系(图1)，支系内序列间平均遗传距离为0.0056，且对应单倍均在同一个单倍型网络内。同时，自测序列与沼水蛙近模式产地(福建福州)一标本的16S rRNA基因序列遗传距离较小(<1%)。因此，初步判断该标本属沼水蛙(Sylvirana guentheri)。

4.2. 短序列影响

本研究从Genbank中下载了31条沼水蛙同源序列，其中3条序列(KR827771, KR827772, KR827773)长度较短(表1)，相较其它同源序列短约26%~28%，为探究类似较短同源序列对系统发育分析结果的影响，本文分别在数据集A1、B1、C1中删除以上3条序列，构成对应的数据集A2、B2、C2。结果表明，A2、B2、C2构建的系统发育树结构与没有删除的短序列的对应数据集基本相似。部分节点支持率有差异，但通过对照样本T检验，删除前后各关键节点支持率没有显著变化。然后，使用R语言程序包haplotypes，对数据集C分析进行单倍型分析时，因为存在短序列而不能顺利构建单倍型网络。在种群动态分析时，删除前后单倍型岐点分布图基本一致，中性检验中，Tajima’s D，Fu’s Fs D值以及R2检验值都更加偏离0。因此，短序列的存在可能对于系统发育树的构建没有较强影响，但分析种群结构及其动态过程存在一定的影响。然后，这种影响的普遍性依赖今后的更多个案分析论证。

5. 结论

本研究使用线粒体16S rRNA基因序列作为分子标记，经过Genbank搜索比对同源序列，构建系统发育树、单倍型网络并计算遗传距离，初步鉴定所采集标本为沼水蛙(Sylvirana guentheri)，为贵州黎平地区该物种的分布新记录。同时，研究发现，较短的同源序列对系统发育分析没有显著影响，但会影响基因单倍型网络的构建。

致谢

感谢六盘水师范学院明湖实验室陈梦、黄影同学在实验室工作方面提供的帮助。

基金项目

国家自然科学基金(31360512)；贵州省科技厅自然科学项目(黔科合J字LKLS[2013]06号)；六盘水师范学院科技创新团队项目(LPSSYKJTD201602)；国家级大学生创新创业训练计划项目(2020-2510)。

NOTES

^*通讯作者。