1. 引言
神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由中枢或外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征，以自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏为特征 [1] ，极大影响患者的生活质量。据统计，世界上有7~10%的人口受该类疾病所困扰。由于发病机制复杂，NP的治疗一直是医药界的难题。抗癫痫药(如加巴喷丁)、抗抑郁药(如三环类抗抑郁药)和抗惊厥药(如卡马西平)常用于临床治疗中、重度神经病理性疼痛，但其疗效有限且伴随嗜睡等不良反应 [2] 。临床二线治疗药物如阿片类镇痛药也具有耐受性、成瘾性等严重副作用 [3] 。因此，寻找更安全、更有效的治疗药物迫在眉睫。
鼠妇始载于《神农本草经》，为卷甲虫科动物卷甲虫Armadillidium vulgare Latreille或潮虫科粗糙鼠妇Porcellio scaber Latreille的干燥全体。味酸，性温，无毒，入肝、肾经。具有利水、通经、化疲、平喘、止痛等功效。临床常用于治疗手术后疼痛、中重度癌痛，效果显著 [4] 。有报道将鼠妇用于肝癌晚期止痛，作用持久性优于杜冷丁 [5] 。化学成分研究表明鼠妇中主要含甾醇类、蛋白质类、生物碱类、有机酸类及脂类化合物 [6] [7] [8] ，对其中镇痛活性成分的研究较少，可能与甾醇类和蛋白类物质有关 [9] [10] ，具体镇痛药效物质仍不清楚。鼠妇对神经病理性疼痛的镇痛作用尚未见报道。本研究通过建立大鼠坐骨神经慢性压迫损伤(Chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)模型，评价鼠妇及其不同极性部位样品对CCI诱导NP镇痛药效作用，为鼠妇临床应用和镇痛药效物质研究累计科学数据。
2. 实验材料
2.1. 药材
鼠妇购自安徽亳州药材市场，经鉴定为卷甲虫科动物卷甲虫Armadillidium vulgare Latreille的干燥全体。
2.2. 动物
SPF级别雄性SD大鼠，重量为180~220 g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司。许可证号为：SCXK(京)2019-0010。实验动物饲养于12 h~12 h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24 ± 2℃，自由饮水和摄食。动物实验经中国药科大学实验动物伦理委员会的批准。
2.3. 试剂
石油醚(无锡市亚盛化工有限公司)、乙酸乙酯(上海申博化工有限公司)、甲醇(江苏汉邦科技有限公司)、柱层析硅胶(青岛海洋化工有限公司)，试剂皆为分析纯。
2.4. 仪器
Von-Frey纤维丝(CA91367) (美国North Coast Medical公司)、热痛刺激仪(意大利Ugo basile公司)、4-0铬制肠线(上海浦东金环医疗用品有限公司)、万分之一天平(瑞士梅特勒仪器有限公司)、台式高速离心机(德国默克集团)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、循环水式真空泵(上海一凯仪器设备有限公司)、恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、分液漏斗(江苏华欧玻璃有限公司)、层析柱(青岛海洋化工有限公司)。
3. 实验方法
3.1. CCI模型制备
雄性SD大鼠麻醉后，右侧俯卧位固定于手术板上。将大鼠后肢大腿外侧剪毛消毒，于左侧股骨中部外侧，顺股骨方向进行切口，钝性分离肌肉组织，暴露坐骨神经，以4-0铬制肠线于坐骨神经处结扎4道，当观测到大鼠小腿肌肉或脚趾有轻微抽动现象，表明结扎松紧程度适宜。缝合皮肤后肌肉注射4,000单位青霉素。对照组只钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，游离周围组织，不结扎坐骨神经。术后14天机械痛阈值和热刺激缩足反射阈值较基础值下降50%以上者视为CCI模型成功，投入实验。
3.2. 机械痛阈值(MWT)测定
采用Von Frey纤维丝法测定大鼠足底MWT。大鼠置于底部为金属网的透明箱内，适应环境15 min。取标度分别为1、1.4、2、4、6、8、10和15 g的纤维丝，垂直刺激大鼠后肢足底5 s，刺激力量以纤维丝弯曲为准。大鼠出现抬足或舔足反应为阳性反应，将刺激所需最低力度记为MWT，重复3次取平均值。
3.3. 热痛阈值(TWL)测定
采用Hargreaves法测定大鼠足底TWL。大鼠置于玻璃板底厚度为3 mm的透明箱内，适应环境15 min。调节刺激光源强度为55℃，刺激大鼠后肢足底，同时开始计时，当出现抬脚、舔脚、躲避等阳性反应时，记录热痛仪上时间为TWL，设定自动切断时间为30.1 s，重复3次取平均值。
3.4. 鼠妇水提物制备
称取100 g鼠妇干燥药材，粉碎并过60目筛，加入10倍量体积水回流提取2次，每次1 h，合并提取液，60℃减压回收溶剂，水定容至100 mL得鼠妇水提物(AVW)。
3.5. 鼠妇不同极性部位样品制备
取鼠妇水提物，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取，每个部位各萃取两次，合并萃取液，回收溶剂至干得到石油醚部位(APF)、乙酸乙酯部位(AEF)，萃取后剩余部分回收至干得到水部位(AWF)。
3.6. 鼠妇硅胶柱层析分段样品制备
取鼠妇水提物，等体积石油醚萃取两次脱脂。水相减压浓缩至浸膏，甲醇复溶，以100~200目硅胶拌样并挥干。按照200~300目层析硅胶：鼠妇浸膏 = 10:1的比例装柱后干法上样，然后分别以石油醚–乙酸乙酯(3:1)、石油醚–乙酸乙酯(1:1)、石油醚–乙酸乙酯(1:3)、乙酸乙酯、甲醇洗脱10个柱体积，洗脱液回收溶剂至干即得不同分段样品。
3.7. 鞘内注射给药
大鼠置于俯卧位，定位髂脊背部，使用微量注射器倾斜30~45度于L5-L6椎间间隙注射。每只大鼠鞘内给药体积为20 μL，观测到大鼠尾部颤抖或突然甩动表明注射成功。
3.8. 统计学分析
统计结果以均数±标准差(x ± s)表示，统计方法采用t检验，P < 0.05即存在显著性差异。所有实验结果使用Microsoft excel，Adobe Illustrator软件作图。
4. 实验方法
4.1. 鼠妇水提物对CCI诱导的神经病理性疼痛镇痛作用
鼠妇水提物对CCI诱导的神经病理性疼痛镇痛药效作用见图1、图2。CCI造模14天后，大鼠足底MWT和TWL均显著降低且逐渐稳定，提示神经病理性疼痛模型制备成功(###P < 0.001，与对照组相比)。单次灌胃给予AVW (0.5 g/kg)可显著抑制CCI模型大鼠足底机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。给药后0.5 h即发挥镇痛作用，0.5~2 h镇痛效果最强，MWT为7.11 ± 1.17，TWL为11.33 ± 1.09，镇痛时间持续至8 h (*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与0 h相比)。而对照组、模型组在0.5，2，4，8 h，其术侧机械痛阈值和热痛阈值与0 h相比无显著差异。
AVW：鼠妇水提物
Figure 1. The effect of AVW on the MWTs of CCI rats (n = 6)
图1. 鼠妇水提物对CCI模型大鼠机械痛阈值的影响(n = 6)
AVW：鼠妇水提物
Figure 2. The effect of AVW on the TWLs of CCI rats (n = 6)
图2. 鼠妇水提物对CCI模型大鼠热痛阈值的影响(n = 6)
4.2. 鼠妇水提物不同萃取部位镇痛活性检测
鼠妇水提物不同萃取部位镇痛药效作用见图3、图4。灌胃给予三个部位(0.5 g/kg)后，乙酸乙酯部位(AEF)和水部位(AWF)均可有效缓解CCI诱导的神经病理性疼痛，给药后0.5~2 h镇痛作用较强，MWT分别为5.89 ± 2.44 (AEF)，4.67 ± 1.03 (AWF)，TWL分别为9.22 ± 0.97 (AEF)，9.93 ± 0.96 (AWF)，镇痛时间持续至8 h (**P < 0.01，***P < 0.001，与0 h相比)。而石油醚部位(APF)镇痛作用较弱，只能轻微抑制CCI大鼠的机械性痛觉超敏(*P < 0.05，与0 h相比)。提示发挥镇痛作用的成分主要集中在中、高极性部位。
APF：石油醚部位；AEF：乙酸乙酯部位；AWF：水部位
Figure 3. The effect of APF, AEF and AWF on the MWTs of CCI rats (n = 6)
图3. 鼠妇水提物不同萃取部位对CCI模型大鼠机械痛阈值的影响(n = 6)
APF：石油醚部位；AEF：乙酸乙酯部位；AWF：水部位
Figure 4. The effect of APF, AEF and AWF on the TWLs of CCI rats (n = 6)
图4. 鼠妇水提物不同萃取部位对CCI模型大鼠热痛阈值的影响(n = 6)
4.3. 硅胶柱层析分段样品镇痛活性检测
对鼠妇硅胶柱层析分段样品采用鞘内注射给药(0.2 mg/20μL)。图5、图6显示，甲醇和石油醚–乙酸乙酯(1:1)洗脱部位可显著增加CCI大鼠足底机械痛阈值和热痛阈值，给药后2 h镇痛作用较强，MWT分别为4.78 ± 1.49，4.78 ± 1.71，TWL分别为10.46 ± 1.43，8.99 ± 1.16 (**P < 0.01，***P < 0.001，与0 h相比)。而石油醚–乙酸乙酯(1:3)洗脱部位镇痛作用较弱，持续时间较短，其他部位几乎无镇痛作用。
P:E (3:1)：石油醚–乙酸乙酯(3:1)部位；P:E (1:1)：石油醚–乙酸乙酯(1:1)部位；P:E (1:3)：石油醚–乙酸乙酯(1:3)部位；Ethyl acetate：乙酸乙酯部位；Methanol：甲醇部位
Figure 5. The effect of silica gel column chromatography elution fractions on the MWTs of CCI rats (n = 6)
图5. 硅胶柱层析不同极性部位对CCI模型大鼠机械痛阈值的影响(n = 6)
P:E (3:1)：石油醚–乙酸乙酯(3:1)部位；P:E (1:1)：石油醚–乙酸乙酯(1:1)部位；P:E (1:3)：石油醚–乙酸乙酯(1:3)部位；Ethyl acetate：乙酸乙酯部位；Methanol：甲醇部位
Figure 6. The effect of silica gel column chromatography elution fractions on the TWLs of CCI rats (n = 6)
图6. 硅胶柱层析不同极性部位对CCI模型大鼠热痛阈值的影响(n = 6)
5. 讨论
中医将神经病理性疼痛归属于痛证，认为“久痛入络”，肝脏、肾脏功能失调与神经病理性疼痛的发生、发展密切关联 [11] 。动物类中药，尤其是虫类药物在治疗肝病、肾病以及镇痛方面有其自身的特点和优势，但对动物类中药的药效作用及其药效物质研究尚鲜见报道。鼠妇作为常见虫类中药，归肝、肾经，临床应用及实验研究均表明鼠妇具有镇痛药效作用 [12] [13] [14] ，但鼠妇发挥镇痛作用的有效部位及活性成分仍不明确，有研究显示鼠妇中甾醇类成分可能是其镇痛药效成分，该类成分可能通过抑制环氧化酶、减少前列腺素合成发挥镇痛作用 [9] ；也有研究表明蛋白类和氨基葡萄糖是鼠妇镇痛活性成分，镇痛机制包括：鼠妇所含兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸可影响单胺神经递质如5-羟色胺的合成，导致脑啡肽释放增加，形成突触前抑制，进而阻断P物质的兴奋性传导，降低疼痛冲动；可抑制嗜中性粒细胞的活性，减少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子在病灶的表达，从而抑制炎细胞浸润，缓解炎症反应对机体正常组织的损伤 [15] [16] 。
本研究首先确证了鼠妇水提物对CCI诱导的神经病理性疼痛具有良好的镇痛作用，并通过不同方法制备鼠妇不同极性部位样品，进一步评价鼠妇不同极性部位的镇痛活性，筛选鼠妇缓解NP的主要药效活性部位。研究结果显示，鼠妇水提物可有效缓解CCI诱导的NP，其中发挥NP镇痛作用的成分主要集中在中、高极性部位，硅胶柱分段部位样品中石油醚–乙酸乙酯(1:1)洗脱部位和甲醇洗脱部位镇痛作用相对较强，提示鼠妇中镇痛活性成分主要富集在这两个部位。本研究首次揭示鼠妇提取物对NP具有良好的镇痛作用，发现主要镇痛物质的主要富集部位，为进一步探索其中的镇痛活性成分，明确鼠妇对神经病理性疼痛镇痛的主要药效物质提供支撑，也为其临床应用和产品开发提供科学依据。