周围血程序性死亡分子-配体2 (sPD-L2)在系统性红斑狼疮中的水平变化及临床意义

Changes in the Levels of Soluble Programmed Death Molecule-Ligand 2 (sPD-L2) in the Peripheral Blood of Systemic Lupus Erythematosus and Their Clinical Significance

摘要: 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性疾病，发病机制仍不明确。初步探讨sPD-L2在SLE患者外周血清中的表达水平变化及临床意义。选择SLE患者101例，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者26例和健康体检者(healthy control, HC) 32例，收集患者的临床资料，抽取周围静脉血，应用ELISA方法检测外周血清中sPD-L2表达水平，根据数据特点和研究目的，采用Mann-Whitney U检验、χ²检验或Spearman相关分析法，比较分析其与SLE常见临床表现及实验室指标的关系。结果：1) 与健康对照组比较，SLE患者周围血中sPD-L2表达显著升高(28.04 ± 3.68 pg/mL vs 7.59 ± 2.07 pg/mL, P < 0.0001)。2) 与RA患者组相比，SLE患者血清中sPD-L2表达显著升高(28.04 ± 3.68 pg/mL vs 23.07 ± 3.39 pg/mL, P < 0.0001)。3) SLE患者中，sPD-L2与年龄(r = 0.296, P = 0.003)，病程(r = −0.245, P = 0.014)，浆膜炎(r = 0.208, P = 0.038)、SLEDAI-2K (r = 0.223, P = 0.026)、抗dsDNA增高(r = 0.205, P = 0.040)、低补体血症(r = 0.196, P = 0.068)、胸膜炎(r = 0.253, P = 0.011)、脓尿(r = 0.271, P = 0.006)、CRP (r = 0.211, P = 0.036)呈正相关关系，而与eGFR呈现出负相关关系(r = −0.360, P = 0.002)。结论：1) 与健康和RA患者人群比较，SLE患者周围血中sPD-L2的表达水平，不仅显著高于健康人群，且显著高于RA患者。2) SLE患者周围血中sPD-L2表达水平与SLE疾病活动度成正相关，可能成为临床判断SLE病情活动程度的潜在生物标志物。

Abstract: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease whose pathogenesis remains unclear. To preliminarily investigate the changes in the expression level of sPD-L2 in the peripheral serum of SLE patients and its clinical significance, a total of 101 patients with SLE, 26 patients with rheumatoid arthritis (RA) and 32 healthy control (HC) patients were selected, the clinical data of the patients were collected, peripheral venous blood was drawn, and the expression levels of sPD-L2 in peripheral serum were detected by ELISA. According to the characteristics of the data and the purpose of the study, it is adopted that Mann-Whitney U test, chi-square test or Spearman correlation analysis were used to compare and analyze their relationship with common clinical manifestations and laboratory indicators of SLE. Results: 1) Compared with the healthy control group, the expression of sPD-L2 in the peripheral blood of SLE patients was significantly increased (28.04 ± 3.68 pg/mL vs 7.59 ± 2.07 pg/mL, P < 0.0001). 2) Compared with RA patients, the expression of sPD-L2 in serum was significantly increased in SLE patients (28.04 ± 3.68 pg/mL vs 23.07 ± 3.39 pg/mL, P < 0.0001). 3) In SLE patients, sPD-L2 was significantly associated with age (r = 0.296, P = 0.003), course of disease (r = −0.245, P = 0.014), serositis (r = 0.208, P = 0.038), SLEDAI-2K (r = 0.223, P = 0.026), increased anti-dsDNA (r = 0.205, P = 0.040), hypocomplementemia (r = 0.196, P = 0.068), and pleurisy (r = 0.253, P = 0.011), pyuter (r = 0.271, P = 0.006), and CRP (r = 0.211, P = 0.036) were positively correlated, while eGFR was negatively correlated (r = −0.360, P = 0.002). Conclusions: 1) Compared with healthy and RA patients, the expression level of sPD-L2 in the peripheral blood of SLE patients was not only significantly higher than that of healthy people, but also significantly higher than that of RA patients. 2) The expression level of sPD-L2 in the peripheral blood of SLE patients is positively correlated with SLE disease activity, which may become a potential biomarker for clinical judgment of SLE disease activity.

1. 引言

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性疾病，其病因非常复杂，至今尚未完全明了 [1] 。据统计，目前系统性红斑狼疮的发病率为30~50/10万人患病，主要是育龄妇女，死亡率为2.4%~5.9% [2] 。系统性红斑狼疮患者临床症状复杂多变，具体表现为发热、面部皮疹、口腔溃疡和关节炎等，严重者可累及全身多个器官，甚至导致死亡 [3] 。

免疫细胞表达的程序性细胞死亡蛋白1 (programmed cell death-1, PD-1)和含粘蛋白域分子-3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule-3, TIM-3)，以及T细胞免疫球蛋白，被称为免疫检查点(Immune Checkpoints, ICP) [4] [5] 。PD-1在体内发挥免疫抑制作用，主要是通过与其配体PD-L1 (B7-H1；CD274)和PD-L2 (B7-DC；CD273)结合，抑制T细胞受体的活化和增殖，减少产生细胞因子，以此调节自身免疫。PD-1与配体PD-L1和PD-L2相互作用，形成一条协同刺激途径，通过抑制细胞增殖、介导程序性细胞死亡和减少T细胞反应，调节T细胞活化、耐受性和免疫介导的组织损伤之间的平衡 [6] 。

在免疫调节途径中，共刺激分子不仅存在膜结合形式，还有可溶形式，PD-L2以可溶性PD-L2 (soluble programmed cell death-L2, sPD-L2)的形式存在于外周血中 [7] 。最近的研究报道，sPD-L2在自身免疫调节中发挥着重要作用，在系统性硬化症中研究提示，血清sPD-L2水平在系统性硬化症中升高，并与纤维化程度和免疫异常相关 [8] 。但SLE患者中sPD-L2的变化及其与疾病发病间的关系，尚未见研究报道。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象

本研究纳入2022年8月至2023年11月就诊安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科住院部及门诊的101例SLE患者(SLE组)，其中女性89例(89/101，88.12%)和男性12例(12/101，11.88%)，平均年龄42.64 ± 11.98岁；26例类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)患者(RA组)，其中女性23例(23/26，88.46%)和男性3例(3/26，11.54%)，平均年龄54.38 ± 7.77岁；以及同期安徽医科大学第一附属医院体检中心进行体检的32名健康人(healthy controls, HC)组，其中男性3例(3/32，9.37%)，女性29例(29/32，90.62%)，平均年龄39.84 ± 8.51岁；三组间年龄与性别分布比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。本研究经医院伦理委员会审查通过，且所有患者均知情同意。

Table 1. General information of SLE, RA, and HC

表1. SLE、RA、HC三组一般资料

2.2. 纳入排除标准

2.2.1. 纳入标准

受试者中，所有SLE患者均符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACR) 1997年修订的分类标准；选取同期在安徽医科大学第一附属医院体检中心进行体检的32名健康人，其年龄和性别与SLE患者组匹配，且排除自身免疫性疾病及相关家族史。

受试者中，RA的诊断依据参照1987年及2010年美国风湿病学会联合欧洲风湿病联盟(European League Against Rheumatism, EULAR)推荐的诊断标准，即累及总分大于6分或以上，可明确诊断为类风湿关节炎。

2.2.2. 排除标准

1) 合并严重心血管疾病、肺部疾病及肝、肾功能不全疾病史的患者(除外SLE疾病本身引起)；

2) 合并恶性肿瘤的患者；

3) 合并其他结缔组织病(如ANCA相关性血管炎、皮肌炎、IgG4相关性疾病、系统性硬化症等)的患者；

4) 合并感染的患者。

2.3. 主要实验仪器与材料

sPD-L2的ELISA试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

2.4. 研究方法

2.4.1. 一般资料收集

收集患者人口学信息，临床资料等，包括姓名、年龄、性别、民族、住院号、门诊号、病程、身高、体重、基础疾病、合并症、临床症状；实验室检查结果：血常规，尿常规，24小时尿蛋白定量，SLE相关抗体：抗核抗体(anti-nuclear antibody, ANA)、抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody, AnuA)、抗双链DNA抗体(anti-dsDNA Ab)、抗SSA抗体(抗SSA)、抗SSB抗体(抗SSB)、抗Smith抗体(anti-Smith antibody，Smith)、抗心磷脂抗体(anti-cardiolipinantibody, ACL)，免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig) G、IgM，IgA，补体成分3 (complementcomponent 3, C3)，补体成分4 (complementcomponent4, C4)，C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，谷丙转氨酶(Alanine amino transferase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate amino transferase, AST)、估测的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, EGFR)、超声心动图结果，以及同时使用2000年SLE疾病活动度(systemic lupus erythematosus disease activity index 2000, SLEDAI-2K)评估SLE患者的疾病活动。

2.4.2. 标本收集

1) 使用促凝管采集SLE组、RA组、NC组受试者各10 ml外周血，采血前嘱受试者空腹8小时以上，采血部位为左/右肘正中静脉。

2) 采集后立刻在低速离心机(L3-5K低速离心机)上离心，条件：10℃，3000 r/min，10分钟，使用移液枪提取血清至EP管中，标注姓名、性别、编号并存入−80℃冰箱备用。

2.5. 酶联免疫吸附法试剂盒定量检测sPD-L2水平

采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)严格按照试剂公司的操作说明使用ELISA试剂盒，测量血清中sPD-L2的表达水平。板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。

2.5.1. 实验原理

试剂盒采用双抗体二步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被人sPD-L2捕获抗体包被微孔中，依次加入标本、标准品孵育，加入生物化抗体进行抗体生物素化，经过温育并彻底后加入HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的sPD-L2呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

2.5.2. 检测前准备工作

1) 需提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2) 将浓缩洗涤液置于室温下的冰箱中，轻轻摇动使其均匀化，待晶体完全溶解后再调整洗涤液。可将20 ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400 ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃冰箱。

3) 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1:20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

2.5.3. 实验步骤

1) 从室温平衡60 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2) 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。

3) 样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加。如果需要稀释样品，使用稀释试剂盒对样品进行必要的稀释。

4) 每孔加入生物素标记抗体50 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30 min；标准孔空白孔不加！

5) 倾倒液体，吸水纸吸净，在每个孔中注入清洗液(350 μL)，静置1分钟，甩掉清洗液，在吸水纸上吸净，然后重复清洗5次(也可使用洗板机清洗)。

6) 在每个标准孔和样品孔中加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，用密封膜封住反应孔，在37℃水浴或恒温箱中孵育30 min。

7) 弃去液体，用吸水纸吸干，向每个孔注入洗液(350 μL)，静置1分钟，冲洗掉洗液，用吸水纸吸干，如此反复。重复洗板5次(也可以用洗板机洗板)。

8) 每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。

9) 每孔加入50 μL终止液，持续15分钟，在450 nm波长下测量每孔的OD值。

10) 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

2.6. 统计学处理

采用SPSS27.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料使用均数±标准差( $\bar{x}\pm s$ )表示，不符合非正态分布计量资料则用中位数(四分位间距) [M (P25, P75)]表示；三组间差异性分析采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；符合正态分布的变量采用Pearson法分析相关性，不符合采用Spearman’s法分析相关性；使用GraphPadPrism9进行图片绘制。所有P值均为双侧检验，小于0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果与分析

3.1. 一般资料

表2列出了101例SLE患者的临床基线特征，SLE组年龄平均为42.64 ± 11.97岁，其中女性89例(88.12%)，26例RA组平均年龄为54.380 ± 7.77岁，其中女性23例(88.46%)；以及32名HC组平均年龄为39.84 ± 8.51岁，女性29例(90.62%)；三组之间年龄和性别互相匹配。

SLE患者平均病程为108 (1~360)月，同时平均SLEDAI-2K评分为10.11，其中，50例(50/101，49.5%)伴有皮肤黏膜受累，37例(27/101，36.63%)伴有肾脏受累，44例(44/101，43.56%)伴有肌肉骨骼受累，24例(24/101，23.76%)伴有血液受累，36例(36/101，35.64%)伴有浆膜炎，6例(6/101，5.94%)伴有胃肠道受累，25例(25/101，24.75%)伴有心脏呼吸受累，13例(13/101，12.87%)伴有发热，12例(12/101，11.88%)伴有血小板减少，18例(18/101，17.82%)伴有白细胞减少，54例(54/101，53.47%)出现抗dsDNA增高，51例(51/101，50.50%)出现低补体血症，42例(42/101，41.58%)出现新出皮疹，3例(3/101，2.97%)出现粘膜溃疡，7例(7/101，6.93%)出现脱发，22例(22/101，21.78%)出现胸膜炎，23例(36/101，77%)出现心包炎，12例(12/101，11.88%)出现脓尿，32例(32/101，31.68%)出现蛋白尿，32例(32/101，31.68%)出现血尿，11例(11/101，10.89%)出现肌炎，40例(40/101，30.96%)出现关节炎，37例(37/101，36.63%)出现肺动脉高压。

Table 2. Clinical and laboratory characteristics of SLE patients

表2. SLE患者组临床及实验室特征

3.2. SLE组sPD-L2表达水平升高

比较健康对照组及RA组外周血清中sPD-L2检测水平，统计学检验结果发现，SLE患者组sPD-L2平均水平28.04 ± 3.68 pg/mL，较RA对照组的23.07 ± 3.39 pg/mL及HC对照组的17.59 ± 2.07 pg/mL对比显著升高(P < 0.0001)，见表3，图1。

Table 3. Comparison of clinical expression levels in SLE, RA, and HC ( $\bar{x}\pm s$ )

表3. SLE组、RA组、HC组的临床表达水平对比( $\bar{x}\pm s$ )

注：方差分析^*P < 0.05；^**P < 0.01。

Figure 1. Serum expression levels of sPD-L2 in SLE, RA group and healthy control group were detected by ELISA

图1. ELISA法检测SLE，RA组，健康对照组sPD-L2的血清表达水平

3.3. sPD-L2表达水平与SLE疾病活动度及相关临床指标的相关性分析结果

统计分析结果显示，sPD-L2与年龄(r = 0.296, P = 0.003)、病程(r = −0.245, P = 0.014)、SLEDAI-2K (r = 0.023, P = 0.026)、CRP (r = 0.211, P = 0.036)呈现出显著正相关关系，而与eGFR (r = −0.360, P = 0.002)呈现出负相关关系，见表4，表5。

Table 4. Correlation between sPD-L2 and disease activity and related clinical indicators

表4. sPD-L2与疾病活动度及相关临床指标的相关性

注：均为t检验^*P < 0.05，^**P < 0.01；浆膜炎评估时同时纳入胸膜炎、心包炎。

Table 5. Correlation between sPD-L2 and related clinical indicators

表5. sPD-L2与相关临床指标的相关性

注：^*P < 0.05，^**P < 0.01；均为Spearman’s相关性分析。

4. 讨论

本研究表明，SLE患者周围血血清中的sPD-L2水平高于健康对照组，亦高于RA患者。SLE是一种自身免疫性疾病，其发病机制尚不清楚，常伴有多器官损害，主要表现为乏力、面部蝶形红斑、关节炎、浆膜炎，严重者可出现全身多器官损害。统计数据显示，系统性红斑狼疮的发病率为30~50人/10万人之间，女性发病率约为男性的11倍，育龄妇女的发病率最高，不同种族的发病率也不尽相同，亚洲高于欧洲和美国，约为3.7~127/10万人 [1] 。另一方面，RA是一种以滑膜炎为特征的全身性自身免疫性疾病，伴有明显的活动受限和残疾，与系统性红斑狼疮不同的是，该病多见于50岁左右的女性 [9] ；女性的患病率约为男性的4倍，中国的流行病学研究显示，RA的患病率约为0.42%，而欧美国家的患病率约为0.5%~1.0% [10] 。在我们的这项研究中，为减少干扰因素，入选的SLE和RA患者组间性别和年龄匹配，无统计学差异。

同时，在自身免疫性疾病中，Xia等人发现IgG4相关疾病患者外周血血浆中sPD-L2的表达水平较高，且sPD-1的水平与IgG4相关疾病的活动性呈正相关 [11] 。Koichi等人发现，系统性硬化症患者外周血清中的sPD-1和sPD-L2升高，并与纤维化程度和免疫异常相关，他们还假设，在系统性硬化症中，T细胞因子是通过T细胞和B细胞之间的同源相互作用产生的，其中膜PD-L2起调节作用 [8] ，然而，他们并未证明sPD-L1的相关性，这可能是因为它们的产生方式不同，膜结合蛋白裂解产生sPD-L1，而sPD-L2是通过选择性剪接产生的，它们与受体结合的分子机制不同，会竞争性地与受体结合，干扰膜PD-L1和PD-L2与膜PD-1的结合 [7] [12] 。提示血清中sPD-1、sPD-L1和sPD-L2的表达水平在自身免疫性疾病的诊断中有极大的潜力。

在较早的一项研究中，Kiraly通过ELISA方法检测了21名盘状红斑狼疮患者、18名亚急性红斑狼疮患者、13名系统性红斑狼疮患者和20名健康对照者的血清sPD-1和sPD-L1水平，结果发现系统性红斑狼疮患者的sPD-1水平明显高于健康对照者，而sPD-L1水平则没有差异 [13] 。但Yan等人检测了系统性红斑狼疮患者外周血清中sPD-1和sPD-L1的表达水平，发现与健康对照组相比，sPD-1和sPD-L1的表达水平升高，可能是由于其样本量不足或试剂盒灵敏度不均导致阴性结果 [14] ，在这项研究中，我们检测了单中心的101名住院及门诊系统性红斑狼疮患者血清中sPD-L2的表达水平，结果显示，与RA组和健康对照组相比，系统性红斑狼疮患者血清中sPD-L2的表达水平升高，且有统计学差异，Hirahara研究系统性红斑狼疮患者血清中的sPD-L2表达水平与SLEDAI-2K评分相关，这与我们的研究一致 [15] 。进一步分析发现，sPD-L2与年龄、病程、浆膜炎、SLEDAI-2K、抗dsDNA升高、低补体血症、胸膜炎和脓尿存在正相关性，在此研究之前尚未见研究报道，SLE的疾病活动包括CRP升高，但CRP升高可由感染引起，本研究纳入的患者均排除合并感染患者，同时SLEDAI-2K评分是评估SLE疾病活动的重要依据，以上研究表明血清中的sPD-L2表达水平可能有助于系统性红斑狼疮的诊断，sPD-L2可能是预测系统性红斑狼疮活动性的潜在细胞因子。

本研究存在有局限性。首先，本研究只检测了患者外周血清中sPD-L2的表达水平，而没有检测它们在细胞表面的表达水平，因此没有研究PD-1/PD-Ls通路在SLE发病机制中的作用；其次，由于本研究的研究对象为汉族人但单中心研究，因此无法确定sPD-L2在不同种族患者中的表达水平和结果偏移。再次，本研究尚未包括检测治疗前后sPD-L2水平的变化，因此需要进一步前瞻性研究来进一步探讨治疗对血清sPD-L2水平的影响。因此，本研究的初步结果未来仍需通过扩大样本量和开展多中心队列研究来证实。

5. 结论

SLE患者的血清sPD-L2表达水平明显高于RA和健康人群，其中，sPD-L2表达水平增加与SLE的疾病活动程度呈正相关，提示SLE患者周围血中sPD-L2可能成为临床有助于评估SLE病情活动度的潜在血清学标志物。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。