NLR受体在水稻效应物诱导的免疫中的作用

The Role of NLR Receptors in Rice Effector-Induced Immunity

摘要: 水稻是重要的粮食作物，在自然生长状态下会面临各种病原体、昆虫的侵害。稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱虫害是对水稻产量和品质影响最严重的三种水稻病害，每年因各种水稻病害造成大量的粮食损失。植物与病原体长期斗争的过程进化出了植物免疫系统。植物免疫系统由两道免疫防线守护植物抵御病原体的入侵。第一层免疫防线由植物细胞表面的免疫受体组成，也是植物的基础免疫防线；第二层免疫防线主要以细胞内的免疫受体NLRs (Intracellular Nucleotide-Binding Site and Leucine-Rich Repeat Receptors)介导的免疫反应。NLRs介导的免疫防御反应是水稻免疫重要组成部分，参与了水稻抵抗稻瘟病菌、白叶枯病菌和褐飞虱的免疫应答过程。

Abstract: Rice is an important food crop, which will face the invasion of various pathogens and insects in the natural growth state. Rice blast, bacterial blight and brown plant hopper are the three most serious rice diseases affecting rice yield and quality, which cause a large amount of grain loss every year. The process of long-term struggle between plants and pathogens has evolved a plant immune system. The plant immune system guards plants against the invasion of pathogens by two immune defense lines. The first layer of immune defense line is composed of immune receptors on the surface of plant cells, which is also the basic immune defense line of plants. The second layer of immune defense is mainly mediated by intracellular immune receptors NLRs. The immune defense response mediated by NLRs is an important part of rice immunity, which is involved in the immune response process of rice against Magnaporthe Oryzae, Xanthomonas oryzae Pv. Oryzae and Nilaparvata lugens.

1. 引言

水稻是世界重要的粮食作物，供养了全球一半以上的人口。然而水稻的整个生长阶段持续不断地受到各种病原菌和昆虫等生物因子的胁迫，每年因各种水稻病害导致粮食产量减少10%~30% ‎[1] 。水稻稻瘟病、水稻白叶枯病和褐飞虱(Brown planthoppers, BPH)是严重影响水稻粮食产量和品质的三种病害。水稻稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)通过分生孢子和菌丝侵染水稻组织局部引起的真菌性坏死 ‎[2] ；水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌致病变种(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)引起，在苗期、分蘖期发病影响最为严重 ‎[3] ；褐飞虱对水稻的危害体现于一是以吸食个产卵对水稻造成机械损伤，二是对传播其他病原体诱发水稻病害 ‎[4] 。目前应对水稻病害的方式主要有使用化学药物和培育水稻抗病新品种，使用化学杀虫(菌)会带来严重地环境污染，而且对粮食本身安全也带去不确定性。因此利用水稻天然的抗病R基因(Resistance Gene)，培育水稻抗病品种是最为经济、环保的策略应水稻病害。

植物在面临病原体侵入时，会通过激活自身的免疫系统来抵御、清除病原体来稳定自身代谢平衡。植物免疫系统由两层防御系统组成：一层由植物细胞表面的病原菌识别受体PRRs (Pathogens Recognition Receptors)识别病原菌上的模式识别分子PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns)激活植物的PTI免疫(Pathogens-Trigger Immunity)；一层是由植物细胞内部一类特殊的免疫受体NLRs识别病原菌分泌的各种效应物激活植物ETI (Effector-Triggered Immunity)。PTI与ETI共同抵御病原菌的入侵，调控植物细胞发出各种免疫应答，包括Ca²⁺外流、ROS (Reactive Oxygen Species)的迸发、MAPK信号传导通路的活化、HR反应(Hyper Reactive)、植物激素水平的变化等 ‎[5] 。

2. NLRs结构域组成、功能和水稻基因组中的分布

NLRs广泛存在于动、植物细胞内，是动植物细胞内重要的免疫受体分子，NLRs包含数个功能结构域，NB结构域(Nucleotide-Binding Domain)和C端的LRR (Leucine Rich Repeat)结构域在不同物种间高度保守，N端结构域是NLRs的核心功能结构域 ‎[6] 。NB结构域具有核苷酸结合位点，能够结合磷酸化的核苷酸，当NB结构域结合的ADP时，NLRs处于非活性状态，但ATP替代ADP结合在NB结构域时，恢复NLRs的功能活性 ‎[7] ；LRR结构域具有特殊的病原菌效应物的识别位点，决定了NLRs识别的效应物特异性。依据植物N端的结构域拥有的特殊结构可将NLR分为三类。一类是具有TIR (Toll and Interleukin-1 Receptor)结构的TIR-NLRs (TNLs)；一类是具有CC (Coiled-Coil)结构的CC-NLR (CLNs)，还有一类是一种特殊的CC-NLR，具有类似RPW8结构，名为RPW8-NLRs (RLNs) ‎[8] 。水稻基因组中有超过400个NLR编码基因分布在12条染色体上 ‎[9] ，其中大多数编码CNLs和某些非典型的TNLs ‎[9] 。

NLR与效应物的识别方式主要分为，直接互作、保卫、诱饵和协同诱饵四种模式 ‎[10] 。Pia-AvrPia间的分子互作是水稻中第一个被发现的NLR蛋白与效应物Avr直接相互作用的例子，AvrPia拥有一个保守的金属蛋白酶结构域，可被Pia C端上的LRR结构域直接结合 ‎[9] ；许多NLR对Avr的识别模式并不是通过直接互作的方式诱发免疫信号，取而代之的是以NLR监测保护某些免疫活化因子免受病原菌效应物的抑制，间接激活免疫反应 ‎[9] 。例如在AvrPiz-t在稻瘟病不同的寄生阶段，会与宿主细胞不同的受体发生互作，如APIP6、APIP10和APIP5，抑制宿主细胞产生ROS和发生免疫反应，但某些与AvrPiz-t作用的细胞受体可被NLR受体Piz-t保护，从而激活强效、高抗的稻瘟病抗性 ‎[11] ；协同诱导模式一般由两个NLR受体组成，一个NLR受体蛋白协同非典型的诱饵结构域识别或结合无毒因子，从而释放另一个NLR蛋白介导稻瘟病抗性。Pik1/Pi2-AvrPik和RGA4/RGA5-Avr1Co39/AvrPia的互作就是典型的协同诱饵模式，在缺乏稻瘟菌的情况下，RGA4和RGA5相互作用形成一对复合体，RGA5抑制了RGA4诱导细胞凋亡和免疫反应活化的功能。一旦遭受稻瘟菌的入侵，RGA4-RGA5复合体通过C端协同结构域RATX1识别AvrPia和Avr1Co39，释放出RGA4，激活ETI免疫 ‎[12] ；此外这种协同作用的NLR基因通常在基因组上相邻或反方向排布，例如Pik-1/Pik-2，Pikm-1/Pikm-2和Pikp-1/Pikp-2互为同源基因，有着相似的免疫激活方式 ‎[13] 。

3. NLR在水稻ETI中的作用

由NLR介导ETI免疫应答有着一个精密、复杂的信号通路。由效应物诱导的植物ETI免疫应答是一种快速强烈的免疫防御反应，通常伴随着超敏反应(Hypersensitive Response, HR)和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)、细胞壁的增厚、有毒代谢物或蛋白的累积、激素的水平的改变 ‎[14] 。

大量文献表明转录因子在NLR介导的ETI免疫过程中发挥着重要作用，NLRs可能通过调控转录因子活性激活ETI免疫 ‎[15] 。OsWRKY45是水稻中一种重要的转录因子，经OsMPK6磷酸化后，恢复活性激活免疫反应和水杨酸合成信号通路 ‎[16] ，在免疫尚未激活时，OsWRKY45由26 S泛素化系统介导蛋白酶体进行降解，但当水稻遭到稻瘟菌入侵时NLR蛋白Pb1直接与OsWRKY45互作，抑制泛素化，激活植物免疫 ‎[17] ；或者是如转录因子APIP5与Piz-t结合，能够稳定APIP5的，相对应的，APIP5也与Piz-t的积累有关，使Piz-t能够介导免疫活化 ‎[18] ，最近研究表明，Piz-t还能与转录因子OsVOZ1、OsVOZ2直接互作调控免疫反应。OsVOZ1是一种转录抑制因子，而OsVOZ2是一种转录激活因子。两者负调控基础免疫但是正调控Piz-t介导的免疫 ‎[11] 。此外在新发现的植物特有的转录因子家族PIBP1成员包含的RRM结构域能够直接与广谱抗性NLR蛋白PigmR、Piz-t和Pi9的N端保守的CC结构域结合，形成免疫复合体进入细胞核中，结合到免疫防御相关基因的AT富集区活化免疫反应 ‎[19] 。以上例子说明NLRs会以募集特殊的转录因子激活免疫反应。

ROS是一种重要的细胞产物，在面临生物、非生物环境胁迫下，在植物信号和细胞反应的调节过程中发挥着核心作用，植物PTI、ETI免疫反应通常伴随着ROS的迸发。ROS通常由位于细胞膜上的一种NADPH氧化酶RBOHs产生 ‎[20] 。OsRac1是一种GTPase，在水稻PTI和ETI免疫过程中正调控ROS合成相关基因 ‎[21] ，OsRac1的活性受质膜上NLR蛋白Pit的激活，诱导ROS的产生，另外OsRac1还能与PID3互作调控NLR介导的稻瘟病抗性 ‎[22] 。

受外界刺激诱导细胞的程序性死亡是个复杂、精密的过程。由NLRs介导免疫活化导致细胞调控死亡被称HR反应。在哺乳动物细胞中NLR蛋白NAIPs识别出细菌的MAPMs，NAIP结合ATP与另一个NLR蛋白NLRC4发生互作，形成寡聚化的炎症小体。炎症小体通过两个蛋白质构成的CARD结构域募集半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，通过Capases途径诱导细胞凋亡 ‎[23] 。水稻虽然已发现不少的NLR受体蛋白，但关于ETI如何诱导细胞凋亡的分子机制尚不明确。目前，关于植物NLRs诱导HR反应机制的研究较为深入的是拟南芥NLR蛋白ZAR1。在受到病原体入侵前，ZAR1同RSK1结合，此时ZAR1结合ADP处于非活性状态；当病原体侵入时，ZAR1与病原菌效应物结合，同时释放ADP，结合ATP。ZAR1-RSK1复合体ZAR1与由病原菌效应物AvrAC修饰的PBL2^UMP结合形成ZAR1-RSK1-PBL2^UMP三元复合物，通过ZAR1间的寡聚化位点形成类似炎症小体的ZAR1-RSK1-PBL2^UMP五聚体结构(如图1所示) ‎[24] 。在此期间ZAR1 N端CC结构域构象发生改变后，CC结构域上第一个α螺旋将形成类似桶装的圆柱体插入到质膜上，这种结构对质膜相关的疾病免疫和细胞凋亡十分重要。ZAR1与某些CNLs在CC端第一个α螺旋拥有保守的MDMA模体，例如茄科植物中与细胞凋亡相关的NLRs、大麦中的MLA ‎[5] 。

Figure 1. Model of AvrAC-induced assembly of the ZAR1 resistosome ‎[24]

图1. AvrAC诱导地ZAR1抵抗小体装配模式 ‎[24]

4. NLRs是水稻抵抗稻瘟病、白叶枯病、褐飞虱的重要免疫受体

水稻12条染色体上分布着超过400个NLR编码基因，然而其中仅有一少部分对水稻真菌性病害稻瘟病、细菌性白叶枯病、褐飞虱具有抵抗能力 ‎[15] 。其中水稻对稻瘟病、褐飞虱的免疫主要由NLRs介导的ETI免疫反应。

在不同的栽培稻、野生稻和陆生稻中，发现了至少37个稻瘟病R基因有功能活性。除Pi-d2、Ptr、Pi21和Bsr-d1几个抗稻瘟病R基因外，其他R基因编码NLR受体蛋白 ‎[13] ，这表明水稻的稻瘟菌抗性主要是由ETI所控制的。某水稻中分离鉴定编码NLR的Pi基因中，对至少11种稻瘟菌的无毒基因(PWL1, PWL2, ACE1, AvrPi9, Avr1CO39, AvrPia, AvrPib, AvrPii, AvrPik/km/kp, AvrPita和AvrPiz-t)具有功能识别活性 ‎[25] 。蛋白质互作模式包括水稻对病原菌的小种特异性抗性是由NLRs赋予的，加强水稻对稻瘟病的抗病性在生产应用中十分有意义，选用广泛的抗性的抗稻瘟病基因更有应用价值 ‎[26] 。隐性R基因pi21，bsr-d1对稻瘟病具有广谱抗性，Pi21编码一种富含脯氨酸的蛋白，具有一个潜在的重金属离子结合结构域HMA (Heavy Metal-Binding Domain)，对免疫应答有着抑制作用，功能缺失的Pi21水稻突变体会解除免疫抑制，从而广泛的增强水稻对稻瘟病的抗性。HMA结构域功能作为一种诱饵蛋白，能够识别各种不同病原真菌毒性效应物，因此也能够活化NLR介导的免疫反应 ‎[27] ；bsr-d1编码C2H2转录因子 ‎[26] ，由于bsr-d1启动子上发生单核苷酸的改变使得一种强转录抑制因子MYB结合到bsr-d1的启动子上，抑制bsr-d1的转录，从而抑制H₂O₂的降解，增强非种属特异性的稻瘟病抗性 ‎[26] 。

白叶枯病是水稻危害最为严重的细菌性病害之一，挖掘新的抗白叶枯病和培育抗白叶枯病品种是预防白叶枯病爆发的重要手段。目前水稻抗白叶枯病基因已经发现超过48个，克隆了15个R基因。其中以Xa1为代表，Xa2、Xa14、Xa31和Xa45都是Xa1的等位基因，均编码NLR受体蛋白 ‎[28] 。Xoo诱导水稻ETI的免疫主要有两种方式，一种是由Xoo分泌的效应物与XA1等NLR受体蛋白结合激活ETI免疫；一种是由Xoo T3SS (Type Ⅲ Secretion Systems)分泌的转录因子类似物TALEs (Transcription Activator-Like Effectors)直接诱导R基因的转录活化。Xoo效应物诱导ETI下游信号通路的机制尚未清晰，并且Xa1等受限于Xoo的小种特异性较少，因此在育种中少有应用。

Figure 2. Molecular mechanisms of insect resistance in rice ‎[13]

图2. 水稻抗褐飞虱分子机制 ‎[13]

注：BPH3、BPH15是一类位于植物细胞质膜上的类植物凝集素受体蛋白，能够识别昆虫的HAMPs/DAMP，活化MAPK途径，诱导PTI。BPH14、BPH9接受褐飞虱的特殊效应物，并诱导ETI，激活下游的ROS、细胞壁的合成、激素信号合成途径；BPH6、BPH30共定位于囊泡复合体，能够增强细胞壁的纤维素和半纤维素的含量。

在水稻种质资源中以分离鉴定出15个褐飞虱(Brown planthoppers, BPH)抗病基因。Li和Liu等绘制了一张BPH R基因分子模式图(如图2)描述了水稻对昆虫病害抗病的分子机制 ‎[13] 。第一个被克隆的BPH R基因Bph14编码CC-NLR蛋白，诱导植物免疫的机制与上述的病原菌诱导植物免疫机制相似。BPH14之间能够形成同源复合物与转录因子WRKY46、WRKY72互作，增强转录因子W-box的结合活性和使其更强效的激活免疫相关基因的表达，如受体类胞内激酶基因RLCK281和胼胝体合成基因 ‎[29] 。还有几个BPH R基因也编码NLR蛋白。Bph9编码一种稀有的NLR蛋白，能够诱导HR反应，BPH9定位于内膜系统上，加强内膜上水稻与BRH的斗争 ‎[30] 。BPH9的LRR结构域可能特异性识别从BPH分离的信号分子，诱发BPH9分子内结构域间的互作，诱使自身的CC结构域活化下游免疫信号和BPH免疫 ‎[31] ；Bph6编码一种新的非经典的LRR结构域蛋白，与外囊复合体共定位，BPH6与外囊亚基OsEXO70E1互作，促进胞质蛋白运输到细胞表面，增强植物细胞壁的强度和硬度，因而对褐飞虱有较广泛的抗谱 ‎[32] 。Bph30是近几年发现的R基因，编码一种新的蛋白，具有两个LRR结构，但与任一已知的LRR结构没有相似性 ‎[32] ，Bph30在厚壁组织中高表达，并能增强纤维素和半纤维素的堆积。增厚的厚壁组织能有效阻止褐飞虱口器的穿刺。Bph40与Bph30类似。Bph6和Bph30都赋予了水稻广泛的褐飞虱抗性。

5. 总结与展望

NLR受体蛋白是植物细胞重要免疫受体，在病原菌效应物诱导的植物ETI免疫发挥核心作用。目前已发现的水稻稻瘟病、褐飞虱的抗病基因中，大多数编码NLR类型的蛋白质，表明由NLRs诱导植物ETI免疫途径是应对稻瘟病菌、褐飞虱的主要免疫方式之一。并且某些NLRs参与植物细胞内生理代谢活动的调控，赋予水稻广泛的抗谱。如Pi21具有免疫抑制作用，Pi21的功能缺失能够解除免疫抑制作用；Bph6参于宿主细胞的囊泡运输，赋予水稻强效的褐飞虱抗性。某些水稻抗白叶枯病基因也编码NLRs，如Xa1及其等位基因，但目前有关Xa1等NLRs介导的ETI的免疫机制还未阐明。

水稻在自然生长状态下面临多种多样的病原微生物或动物的侵害，其中以稻瘟病、白叶枯病、和褐飞虱对我国水稻生产影响最为严重。利用水稻对病害的天然抗病基因培育水稻抗病品种是防治水稻病害的最为经济、绿色环保的手段 ‎[33] 。利用编码NLRs的R基因培育水稻抗病品种是预防和治理水稻病害的重要手段。通过了解不同NLR蛋白在水稻免疫中的作用机制，有助于培育水稻抗病新品种时，针对不同的地区、发病程度的选择利用植物天然抗病基因提供更科学、准确的参考价值。