1. 引言
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常见的神经系统变性疾病,是痴呆最常见的类型,困扰着世界范围内的AD患者近5000万人,我国AD患者约900多万人 [1] 。该病往往隐匿起病,逐步出现进行性的记忆缺失、认知功能下降和行为异常 [2] 。AD的主要病理特征为神经原纤维缠结和神经炎性斑块形成,近几年多项AD全基因组关联分析(Genome wide association studies, GWAS)发现了一些除ApoE以外与SAD相关基因,其中与AD风险最密切的聚集素CLU (Clusterin) [3] 。我们的前期研究结果与国外高加索人群中大型GWAS研究的报道一致,亦验证了多态位点CLU rs1113600是AD的发病风险之一,但CLU具体如何参与AD的发病机制尚不清楚,因此本研究探索CLU如何参与AD的发病机制,具有重要的临床意义。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro cDNA Cloning and Expression Vector (VT8070, YouBio),SH-SY5Y人神经母细胞瘤(上海中科院细胞库),慢病毒包装辅助质粒(REB, GAG, VSV-G), 高保真聚合酶2 × Pfu PCR MasterMix (TIANGEN, KP201-02),FastDigest XbaI (Thermo Fisher Scientific, FD0684),FastDigest BamHI (Thermo Fisher Scientific, FD0054),T4 DNA连接酶(TIANGEN, RT406),DH5α感受态大肠杆菌(TIANGEN, CB101),Tau过表达质粒载体(从西安依科生物技术有限公司EX-Z2846-M98),蛋白上样缓冲液,碧云天。
2.2. 实验方法
2.2.1. CLU过表建立
1) CLU过表达克隆引物序列
利用Primer 6.0软件设计出两对巢式引物,并在第二轮引物添加上特异性酶切位点以便与相应的载体连接(见表1),PCR引物由公司合成。
Table 1. PCR primers sequence of CLU gene
表1. 基因CLU PCR引物序列
2) CLU基因的克隆
目的片段大小约1370 bp,我们可以看到在1000~1500 bp间存在目的条带,克隆成功,将获得的目的条带切胶回收,回收利用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行。
3) 重组质粒与空质粒的转化
已转化CLU过表达质粒的大肠杆菌涂布含有100 μg/mL的氨苄的LB平板上,成功长出菌落,代表转化成功。
4) CLU过表达质粒的PCR检测
CLU过表达质粒的凝胶电泳检测与PCR检测结果,我们可以看到,空质粒载体无目的条带,排除空质粒载体可能存在的干扰,重组CLU过表达质粒1000~1500 bp间出现了目的条带,这与CLU基因1350 bp的位置相符,结果表明质粒构建成功。
5) 慢病毒过表达质粒的测序
CLU过表达载体插入序列有一个碱基的突变,但没有影响氨基酸序列,同时与其他实验室克隆的CLU序列比对后发现与绝大部分实验室克隆结果相同。与韩家淮院士收藏的CLU cDNA序列比对,100%相符。
6) 慢病毒滴度测定
对包装完成的慢病毒进行滴度测定,将包装出来的过表达及干扰慢病毒分别进行倍比梯度稀释,在293T细胞上对包装出的慢病毒颗粒进行其滴度的测定,选择发绿色荧光数目适中孔,数出具体阳性细胞数目,根据公式计算,过表达CLU及空载体的各种慢病毒滴度大约为5~10 × 109 TU/mL范围内,能满足后续试验要求。
7) 慢病毒介导的CLU基因过表达效果的鉴定
将包装出的LV-CLU重组慢病毒以MOI = 1.0在聚凝胺的辅助下分别感染细胞合度达到60%~70%的SH5Y-5Y细胞,同时未感染LV-ORF3重组慢病毒的SH5Y-5Y细胞作为空白对照。37℃培养72 h时,进行细胞样品的收集和对CLU的Qpcr检测结果,可见慢病毒介导的CLU基因在被感染的SH5Y-5Y细胞中成功过表达,可以用于后续试验。
2.2.2. CLU干扰体系的建立
1) CLU干扰双链的合成
用siCLU-F 1 μL,siCLU-R 1 μL,10 × T4 Ligation buffer 1 μL,ddH2O 7 μL的体系,37℃ 30 min,95℃ 5 min缓慢降至25℃,退火形成双链保存,并且利用EcorI、BamHI酶切酶切质粒pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro (见表2)。
Table 2. Interference and negative control sequence of CLU gene
表2. CLU基因的干扰与无义对照序列
2) CLU慢病毒干扰质粒与空质粒的转化
已转化CLU干扰质粒的大肠杆菌涂布含有100 μg/mL的氨苄的LB平板上,成功长出菌落,代表转化成功。
3) 慢病毒过表达质粒的测序
将测序所得的插入载体序列与我们所涉及的CLU干扰序列进行比对,发现其与CLU干扰序列100%匹配,表明CLU干扰载体测序成功。
4) 慢病毒滴度测定
对包装完成的慢病毒进行滴度测定,将包装出来的过表达及干扰慢病毒分别进行倍比梯度稀释,在293T细胞上对包装出的慢病毒颗粒进行其滴度的测定,选择发绿色荧光数目适中孔,数出具体阳性细胞数目,根据公式计算,干扰CLU的各种慢病毒滴度大约为5~10 × 109 TU/mL范围内,能满足后续试验要求。
5) Tau过表达质粒与空质粒的转化
已转化Tau过表达质粒的大肠杆菌涂布含有100 μg/mL的氨苄的LB平板上,成功长出菌落,代表转化成功。
6) Tau过表达质粒的测序
将测序所得的插入载体序列与Tau的CDS序列进行比对,发现有一个碱基突变,密码子由CCG突变为CCA,但此突变为同义突变,并未影响到TAU蛋白的表达,不影响使用使用,Tau过表达载体测序成功,所测质粒序列如下:
>_tauzhili(1)_1810102993Z.seq.Contig1。
2.3. 过表达CLU对神经细胞tau表达的影响
2.3.1. 转录水平的测定
利用QPCR技术在转录水平验证CLU的干扰和过表达,以及CLU干扰和过表达后对Tau的影响,我们发现CLU的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而CLU的干扰同时会引起Tau表达量的降低。
2.3.2. 蛋白水平的测定
利用Western Blotting技术在转录水平验证CLU的干扰和过表达,以及CLU干扰和过表达后对Tau的影响,我们发现CLU的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而CLU的干扰同时会引起Tau表达量的降低。
3. 统计学分析
应用SPSS22.0分析软件进行分析,计数资料选用卡方检验;数据采用mean ± S,两样本采用T检验,多组间比较通过单因素方差(ANOVA)分析法,P < 0.05被认为有统计学意义。
4. 结果
1) 成功构建CLU基因的重组质粒及空转质粒,通过RT-PCR及SDS-PAG凝胶电泳检测,结果表明空质粒载体无目的条带,排除空质粒载体可能存在的干扰,重组CLU过表达质粒在1000~1500 bp间出现了目的条带,与CLU基因1350 bp的位置相符,结果表明质粒构建成功(图1)。
Figure 1. 1, 2 represent PCR detection of CLU genes in recombinant plasmids and empty vector plasmids, while 3 and 4 represent electrophoresis detection of recombinant plasmids and empty vector plasmids, respectively
图1. 1、2为分别为重组质粒和空载体质粒CLU基因的PCR检测,3、4分别为重组质粒和空载体质粒的电泳检测
2) 将CLU质粒转染至SH-SY5Y细胞中及正常SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,进行RT-qPCR检测Tau在CLU过表达模型细胞中表达量明显高于正常组(图2)。
Figure 2. RT-PCR detection of Tau in neural cells of normal group and CLU high expression group
图2. Tau在正常组与CLU高表达组神经细胞的RT-PCR检测
3) 慢病毒过表达质粒的测序(详见图3)。
Figure 3. CLU interference plasmid sequencing peak diagram
图3. CLU干扰质粒测序峰图
4) 利用QPCR技术在转录水平验证CLU的干扰和过表达,以及CLU干扰和过表达后对Tau的影响,我们发现CLU的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而CLU的干扰同时会引起Tau表达量的降低(图4、图5)。
Figure 4. QPCR detection of genes CLU and Tau
图4. 基因CLU及Tau的QPCR检测
Figure 5. QPCR detection of genes CLU and Tau
图5. 基因CLU及Tau的QPCR检测
5) 利用Western-blotting技术在转录水平验证CLU的干扰和过表达,以及CLU干扰和过表达后对Tau的影响,我们发现CLU的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而CLU的干扰同时会引起Tau表达量的降低(图6、图7)。
Figure 6. WB detection of CLU and Tau
图6. CLU及Tau的WB检测
Figure 7. WB detection of CLU and Tau
图7. CLU及Tau的WB检测
5. 讨论
聚集素CLU (Clusterin)是一种存在于人体组织及体液中的较新的凋亡相关蛋白,CLU基因位于人类染色体8p21-12,包括9个外显子,编码449个氨基酸组成的多肽链 [4] ,CLU参与多种生理功能:脂质代谢、免疫系统、炎性反应,细胞凋亡、细胞周期调节,细胞的内吞作用等 [5] 。其改变与额颞叶痴呆等相关。CLU是一种独特的糖蛋白,具有分子伴侣功能,为脑内第二大糖蛋白,由神经元和星形细胞分泌,与APOE具有类似的功能,参与Aβ的清除等 [6] [7] 。CLU其最重要的一个功能是介导细胞的内吞作用,同时CLU在调节肌动蛋白细胞骨架方面亦具有潜在作用 [8] 。此外,CLU可能通过与维持微管稳定的蛋白结合,从而调节微管结构的稳定性。这提示CLU可能参与调节Tau蛋白相关通路从而参与AD的发病机制。
近年国内外研究证实CLU参与AD的发病风险。国外学者研究显示:CLU在脑组织中高度表达,尤其在AD病人海马和内嗅皮层显著增高 [9] ,且与正常对照相比CLU mRNA水平和Clusterin在AD患者增高 [10] 。
近年来国内外研究表明CLU多态性与AD的发生有相关性,具体发病机制不是很清楚,我们研究表明CLU质粒转染至SH-SY5Y细胞中及正常SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,进行RT-qPCR检测Tau在CLU过表达模型细胞中表达量明显高于正常组,证实CLU参与AD的发生,进一步利用QPCR技术在转录水平验证ClU的干扰和过表达,以及ClU干扰和过表达后对Tau的影响,我们发现ClU的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而ClU的干扰同时会引起Tau表达量的降低,且在蛋白水平,我们发现Clu的过表达同时会引起Tau表达量的增高,而ClU的干扰同时会引起Tau表达量的降低,可能导致正常神经元结构破坏,神经细胞功能障碍;随着神经元突触数量减少,神经纤维缠结形成,海马正常结构功能降低甚至消失,导致AD的发生。另外,AD属于遗传和环境因素的共同作用可能发病的根本原因 [11] [12] ,家族成员中有过敏性疾病史是本病的最强风险因素,遗传因素主要影响皮肤屏障功能与免疫平衡。本病患者往往有多种免疫学异常,其中Th2细胞活化为重要特征,还可有皮肤屏障功能减弱或破坏如表皮中聚丝蛋白减少或缺失。环境因素包括气候变化、生活方式改变、不正确的洗浴、感染原和变应原刺激等。生活方式及环境暴露等可能通过表观遗传修饰引起免疫系统与皮肤屏障异常,参与AD的发病。此外,心理因素也在AD的发病中发挥一定作用。有关ClU蛋白的细胞之间物质运输作用,相关研究证实了ClU蛋白可通过膜上megalin/gp330受体介导细胞之间物质的运输 [13] ,进而,推测Tau蛋白单体及Tau重组蛋白进入神经细胞中是通过ClU蛋白调控megalin/gp330受体介导的。megalin/gp330,又名低密度脂蛋白受体相关蛋白2 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 2, LRP2),是一种多配体受体的膜蛋白,可包括Clusterin在内等多项脂蛋白结合,同时大量病例–对照研究证实,megalin与AD存在关性 [14] [15] [16] ;多项研究均表明megalin可作为一种清道夫受体,调控细胞间物质的胞吐及胞吞作用,参与细胞间物质的转运 [17] ,因,CLU可能通过调配megalin受体作用于外源性Tau蛋白胞吞进入神经元胞内。通过构建体内外CLU基因表达模型,在体离及在体研究发现CLU基因可介导Tau病理改变导致AD发生。进而对于CLU表达量增多产生细胞毒性;还是megalin/gp330受体发挥调控发生作用;或者是Tau蛋白“种子”发挥聚集效应;进而促进CLU表达增多是否可调控Tau在神经元内病理播散导致胞内Tau蛋白的增加,从而导致AD的形成,需要进一步研究证实,不仅在离体及在体验证,需进一步在临床病人血液及脑脊进行证实,可能将来为AD治疗带来新的治疗靶点。
6. 结论
通过CLU质粒转染及过表达,调控Tau蛋白播散参与,从而引起阿尔茨海默病的发生。
基金项目
2020度自然科学基金:2020AAC03415。
NOTES
*通讯作者。