1. 引言
利巴韦林(Ribavirin)，化学名为1-β-D-呋喃核糖苷-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺，分子式为C8H12N4O5。它是一种效果良好的广谱抗病毒核苷类药物。目前合成利巴韦林的方法主要包括化学法、酶促法、发酵法。利巴韦林对许多DNA和RNA病毒具有较好的抑制作用。利巴韦林的抗病毒效果显著，但对于三岁以下儿童是禁止使用的，因为利巴韦林具有较多的副作用。杨淼等 [1] 在《利巴韦林在我国7个城市儿科应用现状与合理应用评价》中指出利巴韦林应用存在超适应证及超年龄使用的不合理性，应该建立起针对利巴韦林处方的点评制度，规范利巴韦林在儿科的使用。而王佳等 [2] 利用小儿化毒胶囊联合利巴韦林治疗EV71感染HFMD患儿时的效果显著，能提高免疫功能，减轻炎症反应，保护心肌细胞，减轻脑损伤，促进症状控制，且安全性较高。
近几年来，随着畜牧业的快速发展，畜禽的病死率也在不断上升，由于利巴韦林价格较为便宜且抗病毒效果明显，抗病毒药物的种类较少，新型抗病毒药物的不良反应较多，这导致了利巴韦林这种本应对人类使用的药物在畜牧业中泛滥。农业部在2005年发布的《兽药地方标准废止目录》中明确规定兽药中不能加入利巴韦林及其盐类化合物。当畜禽大量摄入含有利巴韦林药物后，药物会在其体内残留，魏法山等 [3] 在研究利巴韦林在畜禽动物的体内代谢规律时利用利巴韦林药代动力学时得出利巴韦林药物的特点是吸收快、分布广、它能分布于动物全身各组织器官及分泌物、自身消除时间较慢。当人类食用这类的畜禽产品时，会导致人体内的白细胞数量减少，免疫能力下降，严重者影响身体发育。人类摄入动物的药物残留是一个积累的过程，因此，科学的分离、富集、检测食品中的微量的利巴韦林尤为重要。
当前，利巴韦林的检测方法多种多样，例如高效液相色谱法 [4] 、液相色谱–串联质谱法 [5] 、紫外分光光度法、放射免疫法等。但涉及动物细胞、动物血液、肌肉和肝脏中以及兽药中非法添加利巴韦林的测定，由于检测精度高，检测下限低等要求，普遍采用高效液相色谱法(HPLC)或更为灵敏的液相色谱–串联质谱法(LC-MS/MS) [6] 进行分析测定。上述的两种检测方法需要价格昂贵的大型仪器进行分析，同时样品前处理较为复杂以及提取效率不高，经常导致检测物质含量偏低等。分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology, MIT)，是指分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymers, MIPs)的功能单体与模板之间的镶嵌，模拟酶–底物或抗体–抗原之间的选择性识别过程，对印迹分子(也称模板分子)进行的专一识别的技术 [7] 。如秦丹 [8] 就《基于表面分子印迹技术分离检测海洋环境中的典型污染物》进行了用表面分子印迹法制备对氯霉素、诺氟沙星、膝沟藻毒素和氟苯尼考等有特异性识别的分子印迹材料的研究，并通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、红外光谱(FTIR)、比表面(BET)分析、热重(TG)等分析对所制备的材料进行各种表征，并在水溶液中对材料的吸附性能进行了深入研究。将所制备的分子印迹聚合材料应用于海洋环境中特定有机污染物的检测和天然海水提取药物的缓释研究。本文主要对利巴韦林的现行的检测方法进行综述，并探究利巴韦林未来主流的检测方法。
2. 利巴韦林的检测方法
我国在2005年就明令禁止利巴韦林等人用抗病毒药物用作兽药。近年利巴韦林成为了国家食品安全监督的抽检重要项目。动物源食品中利巴韦林的检测方法主要有毛细管电泳法 [9] 、紫外分光光度法、旋光法、高效液相色谱法和液相色谱–串联质谱法等。
2.1. 毛细管电泳分析法
毛细管电泳分析法(capillary electrophoresis, CE)，也称为高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)，是一种用于分离化合物的分析技术。它利用电场作用下，化合物在毛细管中移动的速度不同，根据它们的电荷、大小和形状的不同而进行分离。这种技术在生物化学、药物分析、蛋白质分离等领域被广泛应用。它可以用于分离和检测离子、小分子有机化合物、氨基酸、蛋白质和核酸等各种类型的化合物。基本原理是在一根细微的毛细管中(通常是玻璃或石英制成)，在两端施加高电压。样品以溶液形式注入到毛细管的一端，并在电场作用下，不同成分会根据它们的特性在毛细管中移动。移动速度取决于溶剂流动、电场强度和化合物的性质。最终，化合物会根据它们的特性分离成不同的峰。与常用的高效液相色谱法相比，毛细管电泳法的溶剂使用量较少、试样消耗量少、分离速度较快、分离效率高、应用范围要比常用的高效液相色谱法广、选择性强。在王萍等 [10] 采用毛细管电泳法建立消毒剂和抗抑菌制剂中利巴韦林的检测方法，结果通过对毛细管电泳法的检测波长、样品用量和缓冲体系的选择，确定了最佳的检测条件。检测产品中利巴韦林在一定质量浓度范围内与校正峰面积的良好线性关系。相关系数为0.9999，方法检出限为膏体剂型中20 μg/g和其他剂型中8 μg/g，方法定量限为膏体剂型中70 μg/g和其他剂型中30 μg/g，加标回收率的范围在84.1%~105.9%，相对标准偏差(RSD)均小于5%。在检测消毒剂与抗抑菌制剂中添加利巴韦林的样品中采用毛细管电泳法将电渗流方向的逆转的方法，使样品前处理变得更加简便且仪器的分析检测效率得到提升，该方法的精密度，回收率及准确度都能够满足日常的分析检测需求。韩加怡 [11] 用高效毛细管电泳法，并以多索茶碱药物标准品为内标物进行快速测定利巴韦林及中间体的含量，此方法为采用了石英毛细管柱(未涂层)规格为57 cm × 50 μm，优化选择了25 mmoL/L磷酸二氢钠-12.5 mmoL/L硼砂-25 mmoL/L SDS (pH 7.8)，其中操作电压为20 kV，色谱柱柱温23℃，柱上采用紫外(UV)检测，测定波长为205 nm，气压进样时间为5 s，2次进样期间采用运行缓冲液冲洗毛细管2分钟，得到各物质之间能达到很好的分离，并且拥有良好的线性关系。毛细管电泳法得到的结果快速且准确，但此方法尚未对肉类中检测利巴韦林含量进行相关报道。
2.2. 紫外分光光度(UV-VIS)法
紫外–可见分光光度法(UV-Vis)是以波长为190~800 nm的范围内测定待测物质的吸光度，来鉴别、杂质检查和定量测定的检测方法。紫外可见分光光度法可适用于物质的定性分析，定量分析、纯度分析。特别在物质的定量分析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析检验方法，例如食品，消费品等行业中的产品质量控制。刘亚军等 [12] 用紫外分光光度法测定利巴韦林葡萄糖注射液中利巴韦林的含量，得到利巴韦林的最大吸收波长为206.8 nm，平均回收率为100.06%，相对标准偏差(RSD)为1.04%。但此方法在畜禽动物体内的检测方面研究尚未有进展。
2.3. 旋光法
旋光法(Polarimetry)是一种测量光学活性物质的旋光性质的技术。范宇等 [13] 根据利巴韦林旋光度和浓度的线性关系，采用旋光法测定其半成品，对该实验的方法学数据进行分析，得到利巴韦林溶液在25 g/L~125 g/L的范围内，其浓度与旋光法线性关系良好。优点为旋光法在测定样品时不需任何样品前处理，数据重现性好，而且快速、简便、准确的特点，尤其适用于药品企业的半成品含量控制，但该方法定量水平不足，难以得到精确的含量值。
2.4. 高效液相色谱法
高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)是一种分离和分析化合物的技术，通过液相在固定填料(常见的是硅胶或其他吸附性材料)中的传递来实现。它通常用于生化、药学、食品科学、环境监测等领域。因为HPLC高分离效率、灵敏度高、选择性强以及对多种样品类型适用的优势，所以尤其适合难挥发性的物质、热不稳定物质、离子型物质和生物大分子等的测试。基本原理是将需要分离的混合物通过高压输送液相(通常是溶解在溶剂中的样品)通过填料柱，利用填料对样品分子的亲和性、大小、极性等差异，使不同成分在固定填料中的运移速度不同，从而分离各种组分。如程继业等 [14] 就用高效液相色谱法测定病毒唑霜中利巴韦林的含量时，用水加热熔融制成混悬液，再加入氯化钠溶液盐析沉淀基质，分离提取利巴韦林，最后用高效液相色谱法进行测定。得到利巴韦林在0.01~0.11 mg/mL范围内线性关系良好(r = 1.0000)，平均回收率为100.2% (n = 9)，样品溶液室温放置24 h稳定。近几年来，畜禽因为长期摄入利巴韦林而导致中毒、免疫抑制等问题频频发生，从而使畜禽产品的质量大幅度降低。因此，检验兽药中利巴韦林的含量显得极为重要。而周剑等 [15] 找到了用高效液相色谱法检测兽药制剂中利巴韦林的含量，并对全国12个省份的158个城市所销售的兽药制剂用高效液相色谱法进行检测，最后得到利巴韦林违禁添加的总检出率为4.3%。此方法的检测速度快、灵敏度高、且能准确测量出其含量、并且能够满足兽药产品中利巴韦林的检测要求。
2.5. 液相色谱–串联质谱法
液相色谱–串联质谱法是高效液相色谱法和质谱法的结合，其质谱系统卓越的灵敏度能确保对超痕量物质的最低检出限，具有高性能和可靠性好等标准。王紫竹等 [16] 建立牛奶中利巴韦林残留量的超高效液相色谱–串联质谱分析方法，其利用酶解的方法将利巴韦林代谢物酶解成利巴韦林的原药形式，并通过液相色谱–串联质谱法(LC-MS)进行分析检验，从而准确测定利巴韦林药物的残留总量。结果表明，样品中利巴韦林残留量在1~100 μg/kg浓度范围内线性良好(R2 = 0.9971)，其方法检出限达到：0.50 μg/kg，测定低限为：1.00 μg/kg，两个加标水平的添加回收率在82.6%~115%之间。此方法灵敏、准确，在检测利巴韦林残留量时有很大的实用性。谢继安等 [17] 建立了同位素稀释法，并使用超高效液相色谱–串联质谱法(UPLC-MS/MS)来检测禽类食品中利巴韦林和金刚烷胺类化合物(金刚烷胺、金刚烷甲胺、金刚烷乙胺、3,5-二甲基金刚胺)的残留量。结果表明，利巴韦林在1~100 ng/mL的浓度范围内呈良好的线性关系(r = 0.999)，检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.5 μg/kg。利巴韦林(1.5~15 μg/kg)添加3个浓度的检测结果显示，利巴韦林的回收率为91.4%~103.7%。相对标准偏差(RSD)小于10%。这表明液相色谱–串联质谱法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。
3. 利巴韦林未来可能的主流检测方法
目前，检测利巴韦林的主要方法有高效液相色谱法、液相色谱–串联质谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法和旋光法等。而在检测动物血液、细胞、肝脏和肌肉中利巴韦林含量时一般采用高效液相色谱法和液相色谱–串联质谱法。但面对复杂的样品基质，现行的检测方法无法有效的检测出利巴韦林的具体含量。这就需要一种可以在复杂的样品基质特异性识别利巴韦林的检测方法。
当前有关利巴韦林的检测中涉及细胞、动物血液、肌肉和肝脏以及在兽药中违规加入利巴韦林的检测一般采用高效液相色谱或液相色谱–串联质谱分析测定。但是，由于利巴韦林样品基质过于复杂，要从样品基质中完全提取利巴韦林样品的难度较大。为了提高提取效率，浓缩富集检测利巴韦林。引入新的专一性吸附材料，来富集利巴韦林，使样品含量达到分析仪器的检测下限，从而提高检测精度。
分子印迹技术的核心是制备分子印迹聚合物，然后将需要测定的物质选择合适的模板。该制备方法为：将需印迹的目标分子与合适的功能单体(通常为小分子化合物，也可以为部分不易分解的大分子物质)及交联剂混合，在特定的环境下，使之相互作用并将其聚合，然后，再用适当的方法(清除剂)将共聚物中的印迹分子去除；这样得到聚合物为分子印迹聚合物，这种聚合物有一定的记忆功能，对模板分子进行可选择性吸附 [18] [19] 。而目前制备生物类大分子印迹聚合物的合成方法主要分为两类：包埋法和表面印迹法。包埋法，即聚合后特定的印迹分子被包埋在共聚聚合物中，这个聚合物需要粉碎成小颗粒进行才能后续操作。表面印迹法 [20] 是通常在分子载体的微球上进行表面印迹或覆上涂层印迹聚合物，这样得到的是较均匀的球形颗粒印迹聚合物，可适用于各种操作。在制备利巴韦林分子印迹聚合物时应找到相应的生物分子单体和化学分子单体，以及信号原件。然后使模板分子利巴韦林和与其合适的功能单体与引发聚合反应的交联剂混合，并使其相互作用后进行聚合。再用适当的方法将模板分子利巴韦林在聚合物中去除，这样可以得到利巴韦林分子印迹聚合物。利巴韦林分子印迹聚合物对利巴韦林有双重识别性识别，对利巴韦林有很好的选择性。它可以在复杂的样品基质中富集吸附利巴韦林 [21] [22] ，减少干扰及提高目标物的浓度，配以仪器分析，在多种干扰因素的条件下，不受其他影响而提高检出限。在检测畜禽动物体内利巴韦林时，利用分子印迹技术的专一识别和浓缩富集的特点可以在多种干扰因素下提高方法的检出限，有效地检测出畜禽动物体内的利巴韦林。在未来很可能成为利巴韦林的主流的检测手段之一。
4. 总结
利巴韦林检测方法多样，利巴韦林的检测方法还有比色法、放射免疫法等；相较于高效液相色谱法，旋光法的精确度较低，但该法简便，快速，重现性好。较适用于生产过程中质量控制的快速检验，但很难达到越来越严格的法规要求。高效液相色谱法和液相色谱–串联质谱法在检验时因为基质中组织成分较为复杂，可能导致色谱柱和检测器受到污染，从而在分析过程中受到干扰。分子印迹技术具有特异性识别和富集等特点，为样品前处理提供一个良好的处理方案，可以在检测肉类利巴韦林的残留量中起到重大作用，有较好的应用前景。