两株萘降解菌的降解特性及动力学分析

Degradation Characteristics and Kinetic Analysis of Two Strains of Naphthalene-Degrading Bacteria

摘要: 研究不同萘初始浓度条件下，铜绿假单胞菌ZS1和红球菌b1对萘的降解特性。ZS1和b1菌株最适萘初始质量浓度为分别为200 mg/L和300 mg/L。培养120 h菌株ZS1和b1对萘的降解率分别达到80.45%和87.13%。通过动力学拟合，证实两种菌株对萘的降解过程均符合一级降解动力学方程，降解常数K分别为0.01843 kd/h⁻¹和0.02832 kd/h⁻¹。通过气相色谱–质谱(GC-MS)分析了萘降解阶段的中间产物，并推测了两种菌株降解萘的途径分别为邻苯二甲酸途径和水杨酸途径。

Abstract: The degradation characteristics of naphthalene by Pseudomonas aeruginosa ZS1 and Rhodococcus b1 under different initial concentrations of naphthalene were studied. The optimum initial naphthalene concentrations of ZS1 and b1 were 200 mg/L and 300 mg/L, respectively. After 120 hours of culture, the degradation rate of naphthalene by strain ZS1 and b1 reached 80.45% and 87.13%, respectively. Through kinetic fitting, it was confirmed that the degradation process of naphthalene by the two strains conformed to the first-order degradation kinetic equation, and the degradation constants K were 0.01843 kd/h⁻¹ and 0.02832 kd/h⁻¹, respectively. The intermediate products of naphthalene degradation stage were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the pathways of naphthalene degradation by the two strains were speculated to be phthalic acid pathway and salicylic acid pathway.

1. 引言

多环芳烃(PAHs)是环境中常见的持久性有机污染物，海上运输、石油开发、溢油事故以及工业生活污水排放是海洋环境中PAHs的主要来源 [1] 。多环芳烃已被广泛用于识别石油泄漏，因为它们是石油中毒性最大、最常被检测到的碳氢化合物之一，在石油中含量足够高，而且它们在石油中的分布与其他来源不同。目前去除污水中PAHs的方法有物理、化学和生物方法 [2] 。其中微生物降解PAHs的生物方法具有经济、高效、二次污染少等优势，因此成为去除污水中PAHs的理想方法 [3] 。萘是一种典型的多环芳烃类化合物，目前的研究表明，多种细菌和真菌可通过不同的降解机制降解萘，能够利用多环芳烃作为碳源和能源的微生物在受污染的水、土壤和沉积物中很常见 [4] 。

已报道的萘降解菌很多，主要有反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)、分支杆菌(Mycobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)，红球菌(Rhodococcus)等。这些菌株分布广泛，从陆地到海洋的许多环境生态中都能发现其存在。研究表明假单胞菌菌株在48 h内对800 mg/L萘降解率可达到77% [5] ；从沉积物中分离出可以高效降解菲、蒽和芘的菌群，其降解率能达到91.7% [6] 。铜绿假单胞菌和红球菌株都具有降解难降解有机污染物的能力，是研究有机污染物生物降解最有研究价值的菌属。萘降解的第一步反应中的关键酶是萘双加氧酶。在萘双加氧酶的作用下，萘的水溶性和稳定性都发生了较大改变，生物降解性显著升高 [7] 。此外，在萘的降解过程中，降解基因nahY也发挥着重要作用，在该酶的作用下细菌向萘及其代谢中间产物游动，使得菌株更易接近目标化合物，促进了菌株对萘的降解 [8] 。在萘的降解过程中，催化邻苯二酚开环裂解的酶是邻苯二酚2,3-双加氧酶或邻苯二酚1,2-双加氧酶CatA [9] 。

本实验利用从青岛市黄岛区输油管道爆炸海域筛选出的两种高效石油降解菌铜绿假单胞菌(ZS1)和红球菌(b1)，对其的萘降解特性进行分析，以对萘的降解率为评价指标，研究以不同初始浓度萘为底物对菌株降解的影响，对降解产物进行GC-MS测定，对降解途径进行预测，为微生物降解多环芳烃的应用提供理论参考，对多环芳烃修复技术的发展具有重要意义。

2. 材料与方法

2.1. 菌种来源

实验中使用的菌株是中国山东省青岛输油管道爆炸期间从油污染区(36.07 N, 120.38 E)海水中分离出的两株高效油降解菌。经16次sRNA测序，鉴定为铜绿假单胞菌(ZS1)和红球菌(b1)。

2.2. 主要试剂及培养基

萘、环己烷、甲醇自上海麦克林生化科技有限公司。LB培养基由10 g/L肽酯、5 g/L酵母、5 g/L氯化钠、10~15 g/L琼脂(固体培养基)和4 mL/L微量元素溶液组成。

2.3. 实验方法

2.3.1. 菌种活化和样品的制备

制备了浓度为1 g/L的萘–甲醇溶液，并通过0.22 μm的有机滤膜进行过滤以去除细菌。随后，在无菌操作台上放置过夜，使甲醇充分挥发。按照预定的浓度比例，将挥发后的溶液加入液体无机盐培养基中，从而确保体系中萘的最终浓度分别为100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L和800 mg/L。

将用LB培养基培养至处于对数生长期的ZS1和b1菌液进行离心处理(>5000 g, 5 min)，随后进行重悬。使用无机盐培养基稀释菌液，直至其OD₆₀₀值为1.0时得到菌悬液。按照10%的接种量，将菌悬液接种至无机盐培养基中。在30℃、150 rpm的条件下进行恒温震荡培养，持续7天。期间，每隔1天取样，并使用可见分光光度计测定OD600值，以此反映生物量的变化2.3.2降解率的测定

2.3.2. 萘降解率的测定

按比例取50 mg/L的PAHs溶液分别配置浓度为10、20、30、40、50 mg/L的PAHs标准溶液，以萘浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线。采用了液–液萃取法，环己烷作为萃取剂，按1:1的比例与样品混合，完成萃取后，分离并收集有机相。使用1 cm石英比色皿和紫外分光光度计，在275 nm波长处测定了该有机相的吸光度值。每组实验设3平行，以无菌萘–无机盐培养基三角瓶为非生物对照(CK)。

在连续培养完成后，取20 mL培养液，于4℃、8 000 × g的条件下离心10 min。吸取10 mL上清液，用5 mL环己烷进行萃取，萃取完成后，吸取上层液体用正己烷定容至10 mL。以环己烷为空白对照，用1 cm石英比色皿在萘最大吸收波长处测其吸光值，与不接菌的培养基进行对比，得到菌株对萘的最大降解率。

连续培养结束后，取出20 mL的培养液，并在4℃、8000 × g的条件下离心处理10 min。从中吸取10 mL的上清液，并使用5 mL环己烷进行萃取。萃取完成后吸取上层液体并用正己烷将其定容至10 mL。为了测量萘的吸光值，使用1 cm石英比色皿在萘的最大吸收波长处进行了测量，并以环己烷作为空白对照。通过与未接种菌株的培养基进行对比，得出菌株对萘的最大降解率。

2.3.3. 降解中间产物测定

萃取样经无水硫酸钠脱水处理，先用0.22 μm孔径有机滤膜过滤，经GC-MS测定分析。GC-MS接口温度300℃，色谱柱DB-5MS (30 m × 0.25 μm × 0.25 mm)，色谱条件：初始柱温60℃，保留1 min，10℃/min升温至280℃，之后5℃/min升温至300℃，保留时间4 min。质谱条件为：离子温度230℃，扫描范围(m/z) 40~500，载气为氦气，流速为1 mL/min。

3. 结果与讨论

3.1. 不同萘浓度下萘降解菌生物量分析

本实验选取8个不同的萘浓度作为初始底物浓度进行试验。将菌株接种于含只含萘的无机盐液体培养基中，每隔1 d取样进行测定培养液的OD₆₀₀值，绘制菌株的生长曲线如图1。碳源是菌株生长的必要条件，所以培养基中所含萘的浓度与菌株的生长量有直接关系，当不额外添加碳源时，菌株在无机盐液体培养基中均无法正常生长，在以萘为唯一碳源的培养基中，萘的浓度会影响菌体的生长，进而影响其生物降解效果 [10] 。菌株ZS1和b1在以萘为单一碳源的无机盐培养基中的生长再次证实了对萘的降解能力。图1(a)中当萘初始质量浓度为200 mg/L时，ZS1的生长量最大7天后达到0.72；图1(b)中萘浓度为300 mg/L时，b1的生长量最大达到0.63。萘浓度的八个水平之间均呈显著性差异(P < 0.05)，表明初始萘浓度的各水平对菌株的生长均有很大的影响。两菌株在6 d后进入延滞期，这可能是由于自然环境中的萘浓度较低，加入外源萘后，高浓度的萘对菌体产生了一定的毒害作用；又由于萘的结构稳定不易被降解利用，而且溶解度相对于分离培养基中的碳源(如酵母粉、蛋白胨)较低。碳源的缺乏也会抑制菌株的生长繁殖，但同时也会诱导一些微生物产生和分泌活性降解酶，之后菌株的生长加快，同时也加快了培养液中萘的降解 [11] 。

Figure 1. Growth curves of two strains under different naphthalene concentrations

图1. 不同萘浓度条件下两菌株生长曲线

3.2. 萘降解特性及降解动力学分析

为了进一步研究ZS1和b1生长量和降解萘之间的关系，一级动力学模型可以被用来描述萘的降解，两株菌降解萘的速率可以用以下公式描述：

$\text{C}={\text{C}}_0{\text{e}}^{-\lambda \text{t}}$

式中：C为t时间介质中残留的萘浓度(mg/L)；C₀为介质中萘初始浓度(mg/L)；λ为反应速率常数(d⁻¹)；t为时间(d)。

如图2，随着ZS1与b1生物量增长，萘降解率迅速提高。0~24 h降解率增长较慢，24~48 h降解率快速提高，培养48 h菌株ZS1和b1对萘降解率分别为56.65%和60.68%，均达到50%以上。72~120 h降解增长缓慢，培养120 h菌株ZS1和b1对萘的降解率达到80.45%和87.13%。总体上b1比ZS1降解萘效果更好。

两菌株降解萘的动力学模型与一级动力学模型吻合较好，由表1可知，ZS1降解动力学方程为C/C0 = e^{−0.01843t − 0.26658} (R² = 0.98873)，b1降解动力学方程为C/C0 = e^{−0.02832 − 0.16377} (R² = 0.99185)，b1的降解速率常数k值0.02832大于ZS1的K值0.01843，表明b1比ZS1对萘降解速率更快。研究发现菌株Na-S和菌株Na-b对菲的降解符合一级动力学，降解菲的动力学方程的相关性系数R²为0.983和0.953 [12] 。

Figure 2. Degradation curves and first-order kinetic fitting curves of the two strains

图2. 两菌株降解曲线及一级动力学拟合曲线

Table 1. First-order kinetic fitting equation for naphthalene degradation by strains ZS1 and b1

表1. 菌株ZS1与b1降解萘的一级动力学拟合方程

3.3. 降解中间产物鉴定

用GC-MS对铜绿假单胞菌ZS1和红球菌b1降解萘过程的中间产物进行了定性分析，结果见图3。由图3可知，在不同时间段均发现大量的直链醇，因此推断萘在降解过程中逐渐被开环氧化。tR为12.96、13.19和14.61 min是邻–羟基–顺–苯丙酮酸与其他中间代谢物(存在环状结构)发生反应后的产物；tR为13.70 min是邻–羟基–顺–苯丙酮酸与其他中间代谢物发生反应开环后的产物；tR为15.52 min是邻苯二甲酸二正庚酯的特征峰 [2] 。

Figure 3. GC-MS diagram of degradation intermediates of the two strains (a) ZS1; (b) b1

图3. 两菌株降解中间产物GC-MS图(a) ZS1；(b) b1

3.4. 降解途径分析

加氧酶在多环芳烃化合物的生物降解过程中特别是在羟基化和环裂解反应中起着重要的催化作用。根据GC-MS分析结果，推测菌株ZS1和b1对萘的可能降解途径有2条如图4：一条是邻苯二甲酸途径。萘先代谢为1-羟基-2-萘甲酸，然后在双加氧酶、醛缩水合酶和脱氢酶作用下转化为邻苯二甲酸；另一条是水杨酸途径。萘在双加氧酶作用下生成1,2-二羟基萘，接着被1,2双羟萘双加氧酶转化为2-羟基–苯并呋喃-2-羧酸，在异构酶作用下生成邻–羟基–顺–苯丙酮酸而后被催化为水杨醛，在脱氢酶在作用下生成水杨酸。水杨酸通过羟化酶进一步转化为邻苯二酚和己二烯半醛酸，最后形成乙醛和丙酮酸，这些物质最终通过三羧酸循环(TCA)生成二氧化碳和水 [13] 。

Figure 4. Prediction of degradation pathway of naphthalene

图4. 萘的降解途径预测

4. 结论

1) 设置8个浓度的萘–无机盐液体培养基，以萘为唯一碳源对菌株进行培养，筛选出最适萘降解初始浓度。当萘初始质量浓度为200 mg/L时，ZS1的生长量最大7天后达到0.72；萘浓度为300 mg/L时，b1的生长量最大达到0.63。

2) 培养120 h菌株ZS1和b1对萘的降解率分别达到80.45%和87.13%。同时，动力学拟合发现，两菌株对萘的降解过程都符合一级降解动力学方程。ZS1降解动力学方程为C/C0 = e^{−0.01843t − 0.26658}，b1降解动力学方程为C/C0 = e^{−0.02832 − 0.16377}，降解速率常数k值分别为0.01843和0.02832

3) 经GC-MS分析萘降解阶段的中间产物，检测到tR为12.96 min邻–羟基–顺–苯丙酮酸和tR为13.70 min邻苯二甲酸二正庚酯的特征峰。初步确定了两株菌对萘的降解途径：一条是邻苯二甲酸途径；另一条是水杨酸途径。萘首先被氧化成1,2-二羟基萘，之后脱氢酶作用再开环生成水杨酸、邻苯二酚，最后经过羟化酶等的作用下形成乙醛和丙酮酸，进入三羧酸循环(TCA)。

NOTES

^*通讯作者。