摘要: 本文以野生型水稻石狩白毛(SSBM)和
OsWRKY45过表达(35S-
WRKY45-Flag)为实验材料，使用PEG6000模拟干旱处理，研究其在干旱条件下表达模式及生理指标。结果表明，PEG处理诱导了
WRKY45的表达，35S-
WRKY45-Flag的光合速率、气孔导度及蒸腾速率与野生型相比显著降低，且35S-
WRKY45-Flag增加了水稻的耐旱性；PEG处理两天后，SSBM的SPAD值、地上部鲜重与根鲜重都显著降低，而35S-
WRKY45-Flag处理后SPAD值与根鲜重无显著变化，地上部鲜重显著降低，且处理后35S-
WRKY45-Flag的SPAD值、地上部鲜重与根鲜重都显著高于处理后的SSBM。总之，35S-
WRKY45-Flag在一定程度上增加了水稻耐旱性。
Abstract:
This article uses wild-type rice variety SSBM and OsWRKY45 over expression (35S-WRKY45-Flag) as experimental materials, and uses PEG6000 to simulate drought treatment to study their expression patterns and physiological indicators under drought conditions. The results showed that PEG treatment induced the expression of WRKY45, and the photosynthetic rate, stomatal conductance, and transpiration rate of 35S-WRKY45-Flag were significantly reduced compared to the wild type. Moreover, 35S-WRKY45-Flag increased the drought resistance of rice; after two days of PEG treatment, the SPAD value, fresh aboveground weight, and fresh root weight of SSBM significantly decreased, while there was no significant change in SPAD value and fresh root weight after treatment with 35S-WRKY45-Flags. The fresh aboveground weight significantly decreased, and the SPAD value, fresh aboveground weight, and fresh root weight of 35S-WRKY45-Flags were significantly higher than those of SSBM after treatment. In summary, 35S-WRKY45-Flag has to some extent increased the drought tolerance of rice.
1. 引言
水稻(Oryza sativa L.)是一种重要的谷类作物，世界上将近一半的人口将其作为主食，其中亚洲国家贡献了超过50%的水稻产量 [1] [2] ，而在水稻的生长发育过程中会受到一系列的非生物胁迫，例如：干旱、土壤盐渍化、寒冷、高温以及营养元素的缺失等。这些非生物胁迫对于作物的生长发育以及生产力的发展具有极大的负面影响。随着全球气候变化加剧和人口的不断增长，农业用水需求的增加以及可利用淡水量的降低，干旱胁迫已经成为影响植物产量的一个重要因素，据估计，世界上约三分之一的农田遭受干旱胁迫；且干旱的强度和严重程度很难预测，因为它取决于多种因素，如降雨频率、蒸发速率和土壤水分 [3] [4] [5] 。长期干旱胁迫会抑制水稻的根系生长和养分吸收，从而影响水稻生长以及产量 [6] [7] ，在所有非生物因素中，干旱胁迫每年会降低近50%的水稻产量 [8] ，因此，干旱胁迫已成为农业生产中的一个重要逆境，预计在2050年全球农业需水量将增加一倍，然而淡水供应量可能减少40~60% [9] [10] 。因此，提高作物抗旱能力对于农业可持续发展尤为重要，这也要求我们在了解植物干旱胁迫耐受机制的基础上，进一步培育耐旱品种，提高水稻耐旱能力。
WRKY基因家族是高等植物中最大的转录因子家族之一，在整个植物谱系中均有发现，在调控植物许多生物过程信号网络过程中发挥着重要作用。WKRY转录因子具有多种生物学功能，在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。WRKY转录因子可与靶基因启动子中的W-box TTGAC (C/T)结合，通过自调节或交叉调节激活或抑制下游基因的表达来调控植物对各种胁迫的反应。在蛋白水平上，WRKY转录因子可以与多种蛋白相互作用，包括MAP激酶、组蛋白去乙酰化酶、抗性R蛋白、多种转录因子等，调节植物的生长发育或各种应激反应。
OsWRKY45，它属于WRKY家族的第III组，包含一个保守的WRKY结构域，其在植物应对生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。在水稻(Oryza sativa)中，OsWRKY13、OsWRKY45、OsWRKY53和OsWRKY89调节植物病原抗性，机械损伤、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水杨酸(salicylic acid, SA)处理均能诱导OsWRKY45表达。OsWRKY45定位于细胞核，并在褐飞虱(Nilaparvata lugens (Stal), BPH)诱导的抗病性中发挥关键作用 [11] [12] 。粳稻的OsWRKY45-1和来自籼稻的OsWRKY45-2是位于水稻5号染色体上的等位基因 [13] 。二者都参与了水稻对非生物胁迫的调控和适应，正调控或负调控水稻对脱落酸信号和盐胁迫的反应，但都负调控水稻对寒冷和干旱胁迫的反应，已有研究表明，OsWRKY45突变体对盐和PEG的耐受性较差，在盐和PEG处理后，OsWRKY45突变体的H2O2水平低于野生型，气孔导度高于野生型 [14] 。
本文选择了水稻野生型石狩白毛以及相应的OsWRKY45转基因材料，探讨其在干旱处理下的基因表达模式及各项生理指标，为进一步揭示OsWRKY45在水稻耐旱机制中的作用打下了基础，对于研究水稻应对干旱胁迫，提高水稻产量有一定意义。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
本文所用材料为水稻石狩白毛野生型以及相应的OsWRKY45 (LOC_Os05g25770)转基因材料。
2.2. 过表达载体的构建以及转基因植株表达量分析
本实验构建了一个35S-OsWRKY45-Flag表达载体进行后续实验，本实验用野生型水稻SSBM的cDNA扩增出OsWRKY45基因的编码区(见表1)，利用限制性核酸内切酶Kpn1、Sal1对其进行双酶切，然后连入用相同酶切后的35S-1300-Flag载体中，通过转基因获得材料植株，用于接下来分析鉴定。
表1. cDNA sequence primers
获得转基因苗后，提取其水稻基因组DNA，用OsWRKY45鉴定引物进行PCR扩增，野生型SSBM作为阴性对照，重组质粒作为阳性对照。鉴定阳性的转基因苗提取总RNA，进行逆转录及定量PT-PCR，测定其增强倍数。
2.4. 实验材料的培养
选取近期收取的种子，放入37℃烘箱中烘干，一周后挑选颗粒饱满、大小相仿的水稻种子，剥去颖壳，将其放在水中完全浸泡，37℃催芽，每12小时左后更换一次种子水，培养2~3天，直至种子露白。
在10 L的培养桶中加入水稻全营养液，桶中放入尼龙纱网，将露白的种子均匀地播种在纱网上，放入温室中培养7天左右，培养箱条件设置为夜间22℃，白天30℃，光照时间12小时。7天后将水稻幼苗从纱网上移至泡沫板上，在全营养液中继续培养7天。
22.5% PEG-6000处理：7天后选取8~10颗生长状况相似的水稻，其中4~5颗放入全营养液继续培养，作为对照组；另外4~5颗放入含有22.5% PEG-6000的全营养液中培养48 h，该组为实验组，两组实验条件保持不变。
2.5. SPAD值测定方法
将材料处理两天后，使用SPAD叶绿素仪，选取差异显著的叶片进行测量，本实验选取野生型和转基因苗的第五片叶(L5)。
2.6. 数据处理
采用Excel软件进行数据处理，用Graphpad primer9进行统计分析并作图，显著性水平为P < 0.05。
3. 结果与分析
3.1. PEG处理诱导OsWRKY45的表达
为了明确PEG处理对WRKY45表达的影响，我们构建了OsWRKY45-GUS载体，并鉴定了转基因植株，获得GUS阳性苗。将正常生长两周的GUS阳性苗一部分用22.5%的PEG-6000处理，一部分仍在全营养液中生长。处理两天后，分别剪下对照和处理的GUS苗根部和倒二叶的叶中部分(将根部洗净并吸干水分，叶片切成2~3 mm宽的小段)，完全浸入GUS染液中，出现蓝色时去除染液，将叶片放入70%的乙醇中终止染色，并每24小时更换一次乙醇，直至叶片表面颜色褪去，将根部进行扫描，叶片使用Lecia显微镜进行观察记录。
观察结果显示，PEG-6000模拟干旱处理诱导了OsWRKY45在根中的表达水平，在地上部，该基因在维管束中的表达在干旱之后更加强烈(图1)。
注：图a：左侧为水稻正常营养液培养，右侧为22.5% PEG处理48 h；图b：水稻正常营养液培养叶片；图c：22.5% PEG处理48 h叶片。
Figure 1. Expression pattern of OsWRKY45 in response to drought stress
图1. OsWRKY45在干旱胁迫响应下的表达模式变化
为了进一步验证干旱处理会诱导OsWRKY45的表达，对水稻野生型植株进行22.5%的PEG-6000处理，取处理不同时间的样品进行qRT-PCR，结果表明处理不同时间后，OsWRKY45的表达均被显著诱导，处理12 h、24 h、36 h后，OsWRKY45的表达分别被诱导了15倍、7.5倍和5倍，这也进一步表明，PEG处理会诱导OsWRKY45的表达(图2)。
Figure 2. Relative expression level of OsWRKY45 in wild-type rice before and after PEG treatment
图2. 水稻野生型PEG处理前后OsWRKY45的相对表达量变化
3.2. OsWRKY45过表达增强倍数测定
获得转基因苗后，提取其基因组DNA，用OsWRKY45鉴定引物进行PCR扩增，鉴定阳性的转基因苗提取总RNA，进行逆转录及定量PT-PCR后，发现35S-WRKY45-Flag较野生型相比增强11倍左右(图3)。
Figure 3. 35S-WRKY45-Flag enhancement factor
图3. 35S-WRKY45-Flag增强倍数
3.3. SSBM与OsWRKY45过表达光合速率、蒸腾速率及气孔导度的测定
已有研究表明，在盐和PEG处理后，OsWRKY45突变体的气孔导度高于野生型 [14] 。因此在获得OsWRKY45过表达阳性苗后，我们将野生型水稻SSBM与35S-WRKY45-Flag在全营养液中培养4周，对野生型和转基因苗的倒二叶叶中进行测量，并使用Graphpad prism软件进行数据分析并作图。由图可知，正常生长4周后，35S-WRKY45-Flag的光合速率较野生型降低5倍，气孔导度与蒸腾速率较野生型均显著降低，与之前的结果一致(图4)。
Figure 4. Determination of photosynthetic rate, stomatal conductance, and transpiration rate of SSBM and 35S-WRKY45-Flag
图4. SSBM、35S-WRKY45-Flag光合速率、气孔导度、蒸腾速率测定
3.4. OsWRKY45过表达增强了水稻耐旱性
为了明确WRKY45对水稻耐旱性的影响，我们构建了WRKY45过表达载体，并鉴定了转基因植株，获得WRKY45过表达的转基因苗。我们将正常生长两周的野生型(SSBM)与转基因苗用22.5%的PEG-6000进行处理，处理三天后发现，WRKY45过表达表现出更耐旱的表型，PEG处理三天后，野生型大部分叶片出现干枯、卷曲和弯折等现象，过表达株系叶片卷曲和弯折现象较轻，耐旱性较强(图5)。
注：图a、c正常状态下SSBM和35S-WRKY45-Flag生长状态；图b、d干旱处理后SSBM和35S-WRKY45-Flag生长状态。
Figure 5. Survival status of SSBM and 35S-WRKY45-Flag before and after drought treatment
图5. 干旱处理前后SSBM和35S-WRKY45-Flag存活状态
3.5. SSBM与OsWRKY45过表达干旱胁迫下生物量测定
我们将正常生长两周的野生型(SSBM)与转基因苗用22.5%的PEG-6000进行处理，处理三天后，使用SPAD-502叶绿素仪对野生型和转基因苗的第五片叶叶中进行测量，并使用Graphpad prism软件进行数据分析并作图。由图可知，在PEG处理三天后，野生型SSBM的SPAD值较对照相比显著减少，WRKY45过表达的SPAD值经过处理后无明显变化，且其SPAD值显著大于处理后的野生型。之后对野生型和过表达的地上部及根的鲜重进行了测量，结果发现，经过处理后，SSBM和45-Flag的地上部鲜重与对照相比都显著减少，且处理后，45-Flag地上部鲜重显著高于SSBM。经过处理后，SSBM的根部鲜重与对照相比显著降低，45-Flag处理后与对照无显著差异(图6)。
Figure 6. Biomass measurement under drought treatment
图6. 干旱处理下生物量测定
4. 结论
快速变化的气候条件以及土壤情况影响了正常的农业生产力，并威胁到全球粮食安全 [15] 。干旱胁迫下的水稻，由于其形态生理、生化和分子反应发生变化，从而表现出生长发育不良，产量降低的性状 [16] [17] [18] 。在所有非生物胁迫中，干旱胁迫每年会降低近50%的水稻产量 [8] ，因此，干旱胁迫已成为农业生产中的一个重要逆境。为了应对干旱胁迫，植物也进化出了相互关联的调节机制。在水稻中，WKRY转录因子具有多种生物学功能，参与调控了植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等许多生物学过程。本文所研究的OsWRKY45，它属于WRKY家族，在植物应对生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。先前研究表明，OsWRKY45突变体对盐和PEG的耐受性较差，在盐和PEG处理后，OsWRKY45突变体的H2O2水平低于野生型，气孔导度高于野生型，说明OsWRKY45在水稻应对干旱胁迫方面发挥作用。
为了探究干旱胁迫对OsWRKY45表达量的影响，我们构建了OsWRKY45-GUS表达载体，获得了GUS阳性苗，我们使用PEG-6000模拟干旱胁迫处理OSWRKY45-GUS阳性苗，染色发现该基因被干旱诱导，同时我们取处理不同时间的样品进行qRT-PCR，进一步证明该基因被干旱诱导。因此我们构建了WRKY45过表达载体，我们发现35S-WRKY45-Flag的光合速率、蒸腾速率及气孔导度较野生型均显著降低。之后对转基因苗进行PEG处理三天后，WRKY45过表达表现出更耐旱的表型，其叶片卷曲和弯折程度比野生型较轻；我们对二者的SPAD值、地上部鲜重和根鲜重进行测量发现，处理后的WRKY45过表达株系生物量要显著高于野生型，WRKY45过表达株系较野生型更耐旱。
迄今为止，非生物胁迫仍是阻碍我国农作物产量的关键因素之一，本文发现OsWRKY45会影响水稻抗旱性，其过表达后会增强水稻在干旱条件下的生存能力。在植物应对干旱胁迫的复杂机制中，OsWRKY45发挥了怎样的作用，以及其作用机制仍需进一步研究。之后我们也将继续研究OsWRKY45的作用机制，期望为水稻耐旱研究提供理论基础。