血浆SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测对肺结节的诊断价值

The Diagnosis Value of Plasma SHOX2/RASSF1A/PTGER4 Gene Methylation Detection in the Pulmonary Nodules

摘要: 【目的】探究血浆SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测对肺结节性质判定及诊断的价值。【方法】抽取静脉血8~10 ml进行血浆分离，分离后的血浆进行DNA的提取与制备，其中包括裂解、结合、洗涤、亚硫酸盐转化、脱洗等步骤。进行PCR检测，分别设置SHOX2、RASSF1A、PTGER4甲基化的阈值，检测游离DNA中基因甲基化状态。采用首创的P值(阳性指数，Positive Index)计算公式法分析样本检测数据，依据阳性判断值判定样本阳阴性。【结果】84例胸部CT提示肺结节的患者，进行血浆游离DNA甲基化检测，其中阳性和阴性分别有18例和66例，阳性与阴性结果与患者的性别、吸烟、结节大小、多发与否无关；与年龄、结节的密度及病理类型有关，差异有统计学意义(P < 0.05)。通过金标准病理诊断肺癌有8例，其中6例甲基化检测为阳性，阳性率为75%；恶性结节与良性结节的甲基化阳性指数数值分别为2.00 ± 1.38和1.10 ± 0.92，差异有统计学意义(P < 0.05)。SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化诊断肺癌的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度分别为0.754、75%和84.2%。SHOX2/RASSF1A/PTGER甲基化与病理诊断评定结果存在一致性，Kappa = 0.842。【结论】SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化检测可以成为肺结节性质早期判断的一种可靠且灵敏的新型生物学标志物，为肺癌的早期诊治提供依据。

Abstract: [Objective] To investigate the value of plasma SHOX2/RASSF1A/PTGER4 gene methylation detection in the identification and diagnosis of pulmonary nodules. [Method] Venous blood 8 - 10 ml was collected for plasma separation, and the separated plasma was used for DNA extraction and preparation, which included the steps of lysis, binding, washing, sulfite conversion, desorption and other steps. DNA methylation levels of SHOX2, RASSF1A and PTGER4 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. According to the set threshold, the analysis was performed using dedicated interpretation software. The original P value (Positive Index) calculation formula method was used to analyze the sample test data, and the positive and negative samples were determined according to the positive judgment value. [Result] In 84 patients with pulmonary nodules indicated by chest CT, plasma free DNA methylation of SHOX2/RASSF1A/PTGER4 gene was detected. A total of 84 patients with pulmonary nodules indicated by chest CT were selected for plasma SHOX2/RASSF1A/PTGER4 gene methylation detection, including 18 cases of positive result and 66 cases of negative result. The positive and negative results were not related to gender, smoking, nodule size, or multiple nodules. It was related to age, density of nodules and pathological type. There were 8 patients who were pathologically diagnosed as lung cancer, of which 6 were positive by SHOX2/RASSF1A/PTGER methylation test, and the positive rate was 75%. The methylation values of malignant and benign nodules were 2.00 ± 1.38 and 1.10 ± 0.92, respectively. The area under the curve (AUC), sensitivity and specificity of plasma SHOX2/RASSF1A/PTGER4 gene methylation in diagnosis of lung cancer were 0.754, 75% and 84.2%, respectively. SHOX2/RASSF1A/PTGER methylation was consistent with pathological diagnosis, Kappa = 0.842. [Conclusion] Detection of SHOX2/RASSF1A/PTGER4 gene methylation in plasma may be the reliable and sensitive new biomarkers for preliminary determination of lung nodule properties, and provide a basis for the early diagnosis and treatment of lung cancer.

1. 引言

肺结节是影像学特征为直径≤ 3cm的局灶性、类圆形、密度增高的实性或亚实性肺部阴影，可为孤立性或多发性，不伴肺不张、肺门淋巴结肿大和胸腔积液 [1] 。随着公众对健康的关注和医疗设备与技术的进步，胸部CT的广泛应用能够很灵敏地识别出肺结节。根据肺结节密度的不同被分两大类：即实性肺结节和亚实性肺结节(sub-solid nodule, SSN)，其中，亚实性肺结节又可分为部分实性结节(part-solid nodule, PSN)和纯磨玻璃结节(pure ground-glass nodule, PGGN) [2] [3] 。有研究指出，评估肺结节的良恶性首先需要结合患者的症状、体征、年龄、吸烟史、暴露史、家族史、相关肺部疾病和既往临床史 [4] ，其次是进行影像学的检查和有效的随访，结节的大小、生长和倍增时间都是评估肺结节恶性程度的重要参考依据 [5] 。在我国，肺癌的发病率及死亡率居高不下，超过40%的患者在初诊时多被诊断为晚期恶性肿瘤 [6] 。同时晚期肺癌的治疗手段有限且疗效较差，从而导致其死亡率居高不下。早期的肺癌常表现为肺结节，现目前，组织病理学的诊断仍然是金标准 [7] 。这意味着必须通过侵入性检查或手术取活组织才可确诊，对于那些病理结果提示良性的患者，这往往会过度医疗，给患者带来一定的心理、身体乃至经济负担。因此，寻求一种无创、安全、方便、灵敏的方法尽早的评估肺结节的风险有着重大的意义。

近年来，随着DNA甲基化分析技术的发展，DNA甲基化检测可以作为肿瘤诊断生物标志物和早期肿瘤筛查的新技术 [8] [9] [10] 。启动子区甲基化是一种重要的转录调控因子，与肿瘤的发生发展有着密切的关系 [11] 。同源盒基因家族的成员矮小同源盒2基因(short stature homeobox 2, SHOX2)，它是一种包含着60个氨基酸残基基序的蛋白质 [12] 。同源框蛋白被认为具有复杂的生物功能 [13] 。RASSF1A是一种新型肿瘤抑制基因，参与细胞周期调节、细胞生长和诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展。当它启动子区域异常的高甲基化时，抑制肿瘤的功能就会失活，进而促进肺癌的发生 [14] [15] [16] 。前列腺素E受体4基因(prostaglandin E receptor 4 gene, PTGER4)为原癌基因。相关研究表明血浆中PTGER 4甲基化与其他生物标志物一起联合使用，有助于判定肺结节的性质 [17] 。就肺癌而言，目前在肺癌患者的血浆中都能检测到上述三种基因甲基化，本研究将检测影像学提示有肺结节患者的血浆中游离的肿瘤SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化的情况，明确该检测是否能辅助对肺结节性质的判断，以寻求一种无创的方法，为临床诊断以及后续的临床决策提供思路，最大程度的减少甚至避免重复筛查、侵入性检测、手术和过度治疗。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象

选择2022年2月~2023年12月在大理大学第一附属医院诊治通过肺CT检测发现肺结节并行甲基化检测的患者。经过筛选，最终84例纳入研究。所有甲基化阳性的患者根据组织学和(或)病理结果进行最终的诊断。

2.2. 研究方法

2.2.1. 血浆分离与提取

离心装有8~10 ml全血的游离DNA采血管12 min，离心力1500 rcf，将得到的血浆转移时新的离心管中，吸取2 ml分离好的血浆12 min，离心力1500 rcf转移至提前做好标记的圆锥底的2.0 ml低吸附离心管(eppendorf DNA LoBind Tube 2.0 ml)中。血浆样本可以在2℃~8℃存放不超过3~5天，在−20℃ ± 5℃保存不超过30天。

2.2.2. DNA提取与制备

在分离好的血浆样本中加入3 ml裂解液DL，盖紧离心管盖，用轮状混匀器上室温15 rpm旋转20分钟混匀，加入100 ul混匀后的磁珠进行充分的混匀。充分混匀后将15 ml离心管进行吸附1分钟，丢弃上清液，加入洗涤液1 ml，对磁珠进行反复的吹打，后将磁珠转移至1.5 ml离心管中，涡旋震荡30秒，再次进行30秒的吸附，小心吸弃所有液体，短暂离心后重新吸附30秒，在用200 µl移液器尽量除去残余液体，室温晾干10分钟。在晾干的磁珠中加入亚硫酸盐溶液180 µl、保护液20 µl，将磁珠混匀。将离心管放置到浮漂上，放入水浴锅中，85℃恒温孵育45分钟。向转化后的磁珠反应液中加入600 ul裂解液和300 ul无水乙醇。将离心管置于轮状旋转混匀器中，转速为15 rpm混匀15分钟。混匀结束后进行短暂的离心，再次吸弃所有液体。在1.5 ml离心管中加入1000 µl洗液A，涡旋混匀重悬磁珠15~30秒，进行短暂离心后吸弃所有液体。加入1000 µl洗液B，混匀后离心。将含有磁珠的洗液转移到新的离心管中，将离心管置于磁力架30 s，小心吸弃所有液体。向离心管中加入洗液B1000 µl，进行混匀后短暂离心并小心吸弃所有液体。再次进行短暂离心，用10~200 μl移液器除去尽可能多的残余液体。揭开离心管管盖，等待乙醇挥发，期间不要震荡。将洗脱液40~50 µl加入1.5 ml离心管后涡旋重悬磁珠。室温的条件下，1000 ± 10 rpm，于恒温振荡器中震荡10分钟。震荡结束后，用10~100 µl移液器将洗脱液转移新的离心管中，短暂离心。

2.2.3. PCR检测

每个样本需要做3个PCR反应，根据反应量按比例将相应体积的PCR反应液和引物混合液加入到离心管中制成PCR预反应液，PCR预反应液混匀后短暂离心，将管壁液滴离下来。在8联排PCR管的管孔中加入PCR预反应液15 µl。在PCR管对应的孔中加入10 µl的BisDNA。用管盖密封，振荡混匀后1000 ± 100 rcf离心1分钟，使混合液全部流入管底并且无气泡出现。Applied Biosystems 7500 PCR仪上机，设置基线的起点为第10个循环，终点为第18个循环，分析运行结果。设置SHOX2、阈值15,000，PTGER4阈值为5000，RASSF1A阈值4000，ACTB阈值7000 (可视具体状况进行微调)。荧光定量PCR测试临床样本的SHOX2、RASSF1A、PTGER4基因甲基化，使用数学统计方法分析荧光PCR数据，再结合ROC曲线法及约登指数，获得符合率最高的计算公式和阳性判断值。我们采用首创的P值(阳性指数(Positive Index)计算公式法分析样本检测数据，依据阳性判断值判定样本阴阳性。此检测委托于昆明金域医学检验所有限公司，该公司严格按照说明书操作。

2.3. 统计学方法

采用SPSS23.0进行数据分析。正态分布的连续性变量表示为平均值±标准差( $\bar{X}\pm S$ )，分类变量用频数表示，前者组间差异使用Student t检验，后者采用χ²或Fisher精确检验，P < 0.05为差异有统计学意义；构建受试者工作特征曲线(ROC)，计算截断值以及ROC曲线下面积、灵敏度和特异度；采用Kappa检验分析血浆甲基化检验与病理诊断的一致性。

3. 结果

3.1. SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化与临床特征的关系

SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化结果与患者的性别、吸烟、结节大小、多发与否无关(P > 0.05)。与年龄有关，年龄 ≥ 50和<50岁间差异有统计学意义(P < 0.05)。≥50岁阳性率为32.7% (17/52)、<50岁3.1% (1/32)。不同密度结节间差异有统计学意义(P < 0.05)，实性结节阳性率为15% (9/60)、亚实行结节37.5% (9/24)。与病理诊断有关，不同病理类型的结节间差异有统计学意义(P < 0.05)，恶性结节阳性率为75% (6/8)、良性结节15.8% (12/76)。见表1。

Table 1. Relationship between SHOX2/RASSF1A/PTGER4 methylation and clinical features in 84 patients [n(%)]

表1. 84例患者SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化与临床特征的关系(例(%))

3.2. 良恶性结节中甲基化阳性指数数值、年龄指标比较

在良性结节与恶性结中患者的年龄差异有统计学意义(P < 0.005)。恶性结节中患者的年龄为61.29 ± 4.86，良性结节中患者的年龄为54.86 ± 12.75，说明在恶性结节患者的年龄大于良性结节患者。恶性结节阳性指数数值为2.00 ± 1.38，良性结节阳性指数数值为1.10 ± 0.92，恶性结节甲基化阳性指数数值大于良性结节甲基化阳性指数数值，两组甲基化阳性指数数值差异有统计学意义(P < 0.05)。见表2、图1。

Table 2. Comparison of methylation values between malignant and benign nodules [n, $\bar{x}\pm s$ ]

表2. 恶性结节结与良性结节甲基化数值比较[n, $\bar{X}\pm S$ ]

Figure 1. Comparison of methylation values between malignant and benign nodules

图1. 恶性结节结与良性结节甲基化数值比较

3.3. SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化诊断肺癌的ROC曲线

以SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化阳性指数数值为检验变量，以是否为肺癌为分类变量绘制ROC曲线，结果显示甲基化阳性指数数值诊断为肺癌曲线下面积(AUC)为0.754，最佳截断值为0.592时，灵敏度和特异度分别为75%和84.2% (Z = −0.994, P < 0.05)。见图2。

Figure 2. The ability of SHOX2/RASSF1A/PTGER4 methylation levels to predict lung cancer. The area under the curve (AUC) of the receiver operating curve (ROC) was 0.754

图2. SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化水平预测肺癌的能力。受试者工作曲线(ROC)显示的曲线下面积(AUC) = 0.754

3.4. SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化与病理诊断的一致性分析

结果显示，Kappa = 0.842，U = 7.236，P < 0.001，在0.05水平差异存在统计学意义，表明SHOX2/RASSF1A/PTGER甲基化与病理诊断评定结果存在一致性。见表3。

Table 3. Correlation between SHOX2/RASSF1A/PTGER methylation and pathological diagnosis

表3. SHOX2/RASSF1A/PTGER甲基化与病理诊断的一致性分析

4. 讨论

肺结节的发生发展受多种因素的影响，包括患者的性别、年龄、职业暴露、吸烟、生活环境、慢性炎症等 [18] ，具有起病隐匿、缺乏症状、进展缓慢、早期影像学检查不突出的特点 [19] ，因此需要定期的CT随访及动态观察，尽早的区分出惰性增长和快速增长的持续性肺结节。我们的数据显示年龄在50岁及以上的阳性率高且确诊为肺癌的患者年龄均值为61.29 ± 4.86，因此根据调查，建议常规行肺癌筛查的起始年龄为50岁 [20] 。DNA甲基化被证实广泛的存在于几乎所有的癌症中，高度的甲基化预示着细胞早期癌变的风险 [6] 。对与肺癌来说，在血浆、支气管肺泡灌洗液、肺癌组织、胸腔积液甚至痰液中均能检测得到DNA甲基化。然而，从易获取以及减少有创痛苦的角度来说，使用简单方便的血浆作为样本对于大部分的患者最有吸引力也更易接受 [21] 。

磨玻璃结节或者部分实性结节恶性概率大于实性结节 [22] 。有共识指出，大部分纯磨玻璃结节(pGGN)至少随访7年；部分实性结节(PSN)至少随访3年 [23] 。部分患者在长期的随访动态观察的过程中容易产生焦虑恐慌的情绪，同时也存在过度诊断和过度治疗的情况，因此寻找一种可靠的肺结节诊断评估方法至关重要。我们的数据显示，亚实性结节患者SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化阳性率为60% (9/15)远远高于实性结节15% (9/60)。此类结节需医患共同决策、制订随访时间、增加患者的参与度进行高效的管理，加以重视、及时处理治疗，尽早明确结节的良恶性，对其改善预后和减少疾病负担都有意义。最终通过病理确诊肺癌的患者SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化阳性率75% (6/8)高于良性肺结节15.8% (12/76)，这表明检测SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化对鉴别肺结节性质具有一定的提示作用。杨德平 [24] 等人单独检测了SHOX2和PTGER4甲基化诊断肺癌的灵敏度分别74.1%和39.6%；特异度分别为70.0%和94.6%；联合检验可以提高早期肺癌的检出率，对肺癌的预后及整体的生存率较好。在我们的数据中也同样显示联合检测血浆SHOX2/RASSF1A/PTGER甲基化诊断肺癌的总体灵敏度为75%，特异度为84.2%，能够帮助临床医生早期明确高危结节的性质，有望成为一种可靠的生物学指标。因此，对于早期明确肺结节的性质来说，联合检测比起单基因检测的诊断特异度有所提高。我们的研究存在局限性，我们仅仅采集了血浆作为试验的标本，是否在其他的标本中也存在这种特异性，有待我们的进一步的研究。

研究显示DNA甲基化检测的阳性率与不同的肺癌亚型和肺癌分期有一定的关系，一般关系为小细胞肺癌 > 肺鳞癌 > 肺腺癌 [25] 。HONG CHEN1 [26] 等人分析原发性肺癌组织中RASSF1A和RASGRF2基因甲基化状态与临床病理特征的关系，得出RASSF 1A在100%的小细胞肺癌和70%的非小细胞肺癌中存在高甲基化。Christoph Kneip等 [27] 人以血浆中SHOX 2 DNA甲基化检测不同肺癌亚型也同样得出了小细胞肺癌和鳞状细胞癌检测的灵敏度要高于肺腺癌。然而朱玲 [28] 等人在对PTGER4基因甲基化水平分别诊断肺腺癌及鳞癌时发现，诊断腺癌的灵敏度和特异度分别为90.0%和98.7%大于鳞癌65.8%和96.1%，说明PTGER4甲基化水平诊断肺腺癌的效能优于肺鳞癌。然而在我们的试验中联合SHOX2/RASSF1A/PTGER4甲基化检测发现在6例通过病理诊断确诊为肺癌的患者中，其中有4例为肺腺癌，2例为小细胞肺癌，是否为不同的基因联合提高了腺癌的检出率，我们将进一步加大标本收集数量对其继续研究。多位学者研究显示DNA甲基化随着肺癌的分期的增加，甲基化阳性率及灵敏度随之也增加 [27] [29] [30] 。其原因可能与肿瘤的大小、肿瘤的生长方式、浸润程度、分化程度有关，肿瘤细胞释放更多的基因从而在血浆中更易被检出。

5. 结论

综上，SHOX2/RASSF1A/PTGER4基因甲基化联合检测具有较好的灵敏度和特异度，可以作为现有诊断方法的补充，作为一种可靠且灵敏的新型生物学标志物，有助于对肺结节性质的早期判断，可为下一步的临床决策和诊疗提供新思路，为肺癌的早期诊治提供依据。

基金项目

云南省教育厅科学研究基金(2023Y0999)。