1. 引言
艾纳香(Blumea balsamifera)属菊科(Compositae)艾纳香属(Blumea)植物，多为一年或多年生草本、亚灌木或灌木，常年有香气，是贵州十大苗药之一，也是贵州重点发展的中药材品种之一 [1] 。艾纳香始载于《本草拾遗》，其味辛、微苦，性温，具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒的功效，可用于治疗风寒感冒、头风痛、风湿痹痛、寒湿泻痢、跌扑伤痛等 [1] 。艾纳香挥发油具有抗氧化 [2] 、抗菌 [3] [4] 、抗病毒 [5] 等药理作用。随着艾纳香药理作用及化学成分的深入研究，以艾纳香及其副产品为原料生产的药物逐渐增多 [6] ，如咽立爽滴丸。王国盼等 [7] 从艾纳香叶CO2超临界提取物中共鉴定出78种成分，其中有5种萜类衍生物(31.90%)、44种脂肪族化合物(18.58%)、10种芳香族化合物(18.50%)、12种含氮化合物(14.54%)及部分其它成分。此外，因艾纳香具有独特的香味，还在日用行业及食品行业中被广泛应用。自2009年起，艾纳香慢慢成为创新药物及化妆品邻域新的研究热点，对艾纳香专利中各小类下大组统计分析，发现以未确定结构药物制剂数量最多，有361件，占比45.4%；其次为化妆品或类似的梳妆用配制品，有81件，占比10.2% [8] 。
新薄荷醇是一种环状单萜类化合物，是薄荷精油中薄荷醇的立体异构体 [9] 。因为它的降温作用，常被用作食品、化妆品和药品的调味剂。研究报道，新薄荷醇对人表皮样癌(A431)细胞具有较好的抑制作用，可使A431细胞阻滞于G2/M期，亚二倍体细胞增多。还可通过调节不能降解HA的透明质酸酶的表达来抑制A431细胞的生长，并且干扰透明质酸酶的结构导致细胞的凋亡。由此通过抑制微管蛋白聚合和透明质酸酶活性来延缓皮肤癌细胞的生长 [10] 。新薄荷醇脱氢酶(MNR)参与单萜物质的合成，属于氧化还原酶家族。MNR酶可催化(−)−薄荷酮、(+)−异薄荷酮转化生成(+)–新薄荷醇及(+)−异薄荷醇 [11] 。目前，对艾纳香的研究主要集中在化合物的分离鉴定及药理药效等方面，对其萜类物质的合成途径尚不明晰 [6] 。本课题组以艾纳香叶片为实验材料，对克隆获得到的BbMNR的基因序列进行生物信息学分析，并进行体外蛋白的制备，可为后续功能的验证及萜类物质合成途径的研究提供一定的理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
本研究所用艾纳香(Blumea balsamifera)和Jm109感受态由本实验室保存。RNA提取试剂盒为康为世纪生物科技有限公司；DL2000 maker、pMD18-T、PCR扩增试剂、核酸内切酶和逆转录试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖为北京索莱宝科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒为购自天根生化科技(北京)有限公司。
2.2. 实验方法
2.2.1. 艾纳香BbMNR1基因的克隆
采集I期(芽)、II期(幼叶)、III期(嫩叶)、IV期(成熟期)、V期(衰亡期)新鲜艾纳香叶片提取其RNA送北京百迈客生物科技有限公司构建转录组文库，通过基因注释筛选候选基因。并将RNA逆转录为cDNA，利用Primer Premier 5.0软件设计特异引物(表1)，以艾纳香cDNA为模板，特异性扩增出目的片段经琼脂糖凝胶回收与pMD18-T载体连接，转入Jm109感受态细胞，通过对单克隆菌落进行PCR验证及酶切验证为阳性克隆后，送生工送生工生物工程(上海)有限公司测序。
Table 1. Primers were used in this study
表1. 本研究所用引物
2.2.2. 艾纳香BbMNR1生物信息学分析软件
运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对及系统进化树的构建，利用生物信息学软件(表2)对BbMNR1氨基酸序列蛋白质理化性质、二级结构以及三级结构分析。
Table 2. Bioinformatics analysis software
表2. 生物信息学分析软件
3. 结果与分析
3.1. 艾纳香BbMNR1基因克隆
本研究基于本课题组前期得到的艾纳香转录组数据，筛选出五条候选的MNR基因，其中基因BbMNR1 (序列号：F01_transcript_29671)在艾纳香叶片中表达量最高(图1(A))。以艾纳香总RNA (图1(B))为模板，并设计引物，通过RT-PCR技术克隆得到一条大小为903 bp基因(图1(C))，PCR胶回收产物与pMD18-T载体连接，并转入Jm109感受态中。通过菌液扩增(图1(D))及酶切产物(图1(E)) 1%琼脂糖凝胶电泳，确定为阳性克隆，将重组质粒送生工生物有限公司测序。测序结果与转录组数据相符，BbMNR1基因开放阅读框(ORF)如(图1(F))，菌种−80℃保存。
Figure 1. Cloning of Blumea balsamifera BbMNR1 gene
图1. 艾纳香BbMNR1基因克隆
注：M：DL 2000 DNA marker；A：转录组数据；B：总RNA；C：PCR扩增；D：琼脂糖凝胶回收产物；E：酶切验证；F：ORF序列。
3.2. 艾纳香BbMNR1系统进化树构建及生物信息学分析
3.2.1. 艾纳香BbMNR1系统进化树构建
Figure 2. BbMNR1 and other plant protein polysequences
图2. 艾纳香BbMNR1与其他植物蛋白多序列比对
本研究利用NCBI在线Blastp对BbMNR1蛋白同源序列比对后发现，BbMNR1基因编码的蛋白序列与其他植物MNR序列进行多序列比对，包括薄荷(Mentha x piperita) (5L51.A)、大豆(Glycine max) (XP_014626312.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Q9M2E2.1)、辣椒(Capsicum annuum) (B2X050.1)、薄荷(Mentha x piperita) (Q6WAU1.1)、曼陀罗花(Datura stramonium) (MCD9643570.1)、毛果杨(Populus trichocarpa) (XP_002301348.2)、麻风树(Jatropha curcas) (XP_012083439.1)、大桉(Eucalyptus grandis) (XP_018727894)、木薯(Manihot esculenta) (XP_021615637.1)、橡胶树(Hevea brasiliensis) (XP_058008369.1)、辣椒(Capsicum annuum) (KAF3616948.1)、葡萄藤(Vitis vinifera) (RVW27891.1)、苦楝(Melia azedarach) (KAJ4726980.1) (图2)。他们均具有经典的短链脱氢酶/还原酶(SDR)活性位点基序 GXXXGXG (图2红色方框)和YXXXK (图2黑色方框)，艾纳香BbMNR1与曼陀罗花、辣椒相似度分别为68.33%、67.24%，可能行使相似的功能。
Figure 3. Phylogenetic tree of BbMNR1 with other homologous proteins
图3. 艾纳香BbMNR1和其他同源蛋白的系统进化树
利用MEGA软件对得到的BbMNR序列进行系统进化树的构建，采用邻近法构建进化树，发现艾纳香BbMNR1与曼陀罗花和辣椒聚为一支(图3)，说明其亲缘关系较近。
3.2.2. 艾纳香BbMNR1蛋白的生物信息学分析
本研究运用ProtParam tool在线工具对BbMNR1蛋白序列进行基本理化性质分析，结果显示，该蛋白由300个氨基酸编码组成，相对分子质量为32.57 kDa，分子式为C1447H2299N387O446S10，等电点为5.41，不稳定系数为21.94，平均亲水系数为−0.112，脂肪族氨基酸指数为92.63。NCBI CDD数据库显示该蛋白具有card-red-PTCR-like-SDR结构域，属于NADB-Rossmann superfamily (图4(A))。亲疏水性预测分析显示，疏水性最强的是第151、251位氨基酸残基，指数为1.7；亲水性最强的是第115位氨基酸残基，指数为−2.2 (图4(B))。BbMNR1蛋白不存在跨膜结构域(图4(C))，不含信号肽(图4(D))，为非分泌蛋白。亚细胞定位预测结果显示，BbMNR1蛋白定位于细胞质。
二级结构预测结果显示，BbMNR1蛋白的二级结构中含47.67%的α-螺旋、28.67%的无规则卷曲、14.67%的延伸链、9.00%的β-折叠(图4(E))。运用SWISS-MODEL以薄荷新薄荷醇脱氢酶(MpMNR，ID：5l51.1.A)为模板进行同源建模，对BbMNR1蛋白的三级结构进行预测(图4(F))，结果显示，该蛋白与模板的同源性为54.21%；全局模型质量估计(Global Model Quality Estimation, GMQE)值为0.79。
注：A：结构域预测；B：疏水性预测；C：跨膜结构域预测；D：信号肽预测；E：二级结构预测 F：三级结构预测。
4. 讨论与结论
新薄荷醇是一种环状单萜类化合物，与薄荷醇具有相似的原子排列及稳定性差异。新薄荷醇脱氢酶基因(MNR)在新薄荷醇的合成中途径中起到至关重要的作用，MNR属于氧化还原酶家族 [9] 。有研究表明，新薄荷醇对人表皮样癌A431细胞有明显的抑制作用，其作用机制是阻断细胞周期，增加亚二倍体细胞的数量，并影响微管蛋白聚合，且新薄荷醇的抗增殖潜力相较于薄荷醇更好 [10] ，这意味着新薄荷醇在抗肿瘤中具有较大的潜力。
早期研究发现，重组MNR酶可将(−)−薄荷酮转化为95% (−)−(3R)−薄荷醇和5% (+)−(3S)−新薄荷脑，将(+)−异薄荷酮转化为87% (+)−(3S)−新异薄荷脑和13% (+)−(3S)−异薄荷脑。有研究表明，与MMR相比MNR对薄荷酮还原的催化效率低约2000倍 [11] 。由此推测，新薄荷醇含量少与MNR酶催化效率低有极大关系。随着进一步研究，从桂花花瓣中克隆获得1个桂花Of MNR基因的cDNA全长，采用qPCR技术检测了OfMNR在桂花2个品种的不同组织和不同花期中的表达量，发现OfMNR在2个品种中花瓣的表达量均最高，预示着MNR基因可能和桂花的香味成分的合成有关 [12] 。
本研究根据艾纳香转录组数据，克隆得到903 bp大小的BbMNR1基因。并进行生物信息学分析，结果显示该蛋白为不稳定的亲水性的非分泌蛋白，且该蛋白具有经典的SDR保守结构域，属于NADB-Rossmann超家族。大多数脱氢酶具有至少2个结构域，第一个结构域在序列N末端与辅酶(通常是NAD)结合，第二个结构域与底物结合。后一个结构域决定底物特异性并包含参与催化的氨基酸 [13] 。该蛋白二级结构与三级结构预测显示，其结构中主要为α–螺旋和无规则卷曲。同时系统进化树分析发现，BbMNR1蛋白与番茄SlTPS40蛋白同源性较高，属TPS-c亚型。TPS基因家族包含TPS-a、b、c、d、e/f、g、h 7个亚家族，TPS-c亚家族中主要包含小立碗藓中的PpCPS/KS和被子植物、裸子植物中的CPS蛋白 [13] 。此外，詹亭 [14] 对艾纳香萜类合酶进行研究，成功鉴定出4个单萜合酶基因和1个多产物萜类合酶基因，进行烟草瞬时表达发现这些基因可在体内产生水芹烯、柠檬烯和α–松油醇。目前，已有许多与植物性状有关的基因被克隆出来，并进行了功能的验证，之后对MNR基因的研究也会更加深入 [15] [16] [17] [18] 。
基因克隆技术已愈发成熟，可从动植物及微生物中克隆到具有特定功能的基因，如猪 [19] 、肉桂 [20] 、广藿香 [21] 和丹参 [22] 。综上所述，为了揭示艾纳香中单萜代谢途径，后续验证该基因的功能研究一方面可从体外酶活性检测进行，另一方面可构建过表达载体，通过转化模式植物进行体内代谢物含量测定验证BbMNR1基因的功能。艾纳香为贵州十大苗药之一，有重要的药用价值。因此，研究艾纳香中新薄荷醇脱氢酶对改善艾纳香品质有重要作用，也可为其他植物MNR基因的研究提供思路。
基金项目
本研究由贵中医大创合字(2021) 36号、贵州省科技厅基础研究项目(黔科合基础[2019] 1019号)和贵州省“千层次”人才项目(贵中医[ZQ2018004])共同资助。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。