1. 引言
乳腺癌是在世界上女性人群中癌症相关死亡的主要原因，更不幸的是，乳腺癌的全球负担在发达国家和发展中国家中都在增加，它的发病率并没有降低的趋势 [1] 。癌症复杂的分子机制决定了它的异质性，因此肿瘤内部的异质性强化了它适应不断变化的约束条件的能力 [2] 。那么对于乳腺癌而言，它的进展与激素受体(Hormone receptor, HR)和人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor, HER2)的表达有着密切的关系，这种类型乳腺癌的主要治疗手段为内分泌治疗，然而治疗过程中出现的药物耐药和癌症的复发是个重要挑战 [3] 。近几年来，靶向细胞周期药物细胞周期蛋白依赖性激酶4和6 (cyclin-dependent kinase 4 and 6, CDK4/6)抑制剂联合相关的内分泌药物在临床上的应用给激素受体阳性乳腺癌患者看到了新的希望。尤其是国外PALOMA、MONALEESA和MONARCH三个系列的II期III期临床试验的结果提示，CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗组的无进展生存期(PFS)显著改善，相关分子机制的深入研究中发现CDK4/6抑制剂具有可调控乳腺恶性肿瘤细胞周期，从而起到阻断肿瘤细胞增殖的作用，此外，2021年ASCO会议上报道的新CDK4/6抑制剂dalpiciclib联合氟维司群在DAWNA-1 III期临床试验中的PFS为15.7个月，相比安慰组+氟维司群组(7.2个月)明显提高 [4] [5] 。这些试验研究结果证实，在长期治疗和随访观察中发现，CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗会显著改善患者PFS，从而改善患者生存和生活质量，因此这些研究的结果进一步证实CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗法比单用内分泌药物治疗HR+/HER2−乳腺癌的作用更明显，疗效更好，药物耐药性可控等优点。但是药物所引起的耐药机制还在不断地研究当中 [6] [7] 。现就以乳腺癌相关治疗中CDK4/6抑制剂作用机制及相关耐药机制方面予以综述。
2. CDK4/6抑制剂的概述
在正常的细胞周期中，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)发挥着关键的作用，为了确保细胞的分裂成功，它们的活性在细胞分裂过程中受到严格的控制。特别是，所有细胞分裂都要在细胞周期的DNA合成期(S期)发生DNA的复制，并且此过程中有序的分裂染色体的必要机制，从而导致细胞的产生。在乳腺恶性肿瘤中，CDK4和6的作用更为关键，它们可以控制细胞从DNA合成前期(G1期)至DNA合成期(S期)的转变，它们的活性主要受细胞周期蛋白D (cyclinD)的调节，D家族细胞周期蛋白中有多种细胞周期蛋白能够促进CDK4和6的活性，最具有代表性的是细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)，它们通常在乳腺癌中出现失调。细胞周期蛋白D1与CDK4和6结合形成cyclinD1-CDK4/6复合物，这种复合物释放ATP，从而提供能量可导致视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)蛋白的磷酸化。RB是一种肿瘤抑制蛋白，它与腺病毒2区早期结合因子(adenoviral early region 2 binding factor, E2F)相结合，可抑制细胞分裂的进程。当被激活时，磷酸化的RB就会从BR-E2F复合物中解离，解离后E2F可以协助靶基因的转录，从而允许细胞从G1期到S期的转变 [7] 。因此CDK对细胞有丝分裂过程至关重要，通常被恶性肿瘤用来促进不受控制的肿瘤细胞增值和生长。此外，在HR+乳腺恶性肿瘤患者中，cyclinD1通路和雌激素受体(estrogen receptor, ER)相互之间存在关联 [7] 。通常ER以cyclinD1为突破点，加速形成cyclinD1-CDK4/6复合物，从而加速乳腺恶性肿瘤进程，因此对CDK4/6抑制剂具有较高的敏感性 [8] 。
3. CDK4/6抑制剂治疗HR+/HER2−乳腺癌的作用机制
3.1. CDK4/6抑制剂对细胞周期的作用
细胞周期通常被细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)严格控制，研究表明，细胞周期蛋白Ds-CDKs轴通过调控细胞生长、转移、凋亡和血管形成等多种方面在乳腺恶性肿瘤中起着重要作用，因此细胞周期异常失调是乳腺恶性肿瘤的标志之一 [9] 。而CDK4/6抑制剂作用于cyclinD1-CDK4/6复合物，阻断CDK4/6介导的视网膜母细胞瘤蛋白(RB)磷酸化，使腺病毒2区早期结合因子(E2F)无法释放和激活相关基因的表达，从而阻止癌细胞从G1期向S期的转变，达到阻止癌细胞增殖和生长的目的 [9] 。
3.2. 改变肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)
肿瘤微环境(TME)可直接影响肿瘤细胞繁殖、转移、扩散和凋亡。而CDK4/6抑制剂在以下几个方面改变肿瘤微环境。第一，CDK4/6抑制剂(Abemaciclib)降低DNA甲基转移酶1 (DNMT1)的表达，导致随后的DNA低甲基化。进而介导癌细胞中内源性逆转录病毒成分，推动干扰素(IL-29，IL28a和IL28b)形成，从而诱导肿瘤微环境并提高抗肿瘤免疫力 [10] 。第二，CDK6是活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)的上游调控元件，CDK4/6抑制剂抑制NFAT磷酸化，提高T细胞活性并诱导炎症微环境，进而增强抗肿瘤的作用 [11] 。第三，通过抑制调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)的增殖和Treg细胞中DNA甲基转移酶1 (DNMT1)的表达，导致肿瘤细胞内E2F的释放，提高肿瘤微环境中T细胞的数量，增强对癌细胞的杀伤能力 [12] 。第四，CDK4/6抑制剂可以增加肿瘤程序性死亡配体1 (programmed death ligand 1, PD-L1)的表达，从而诱导肿瘤MTE并提高肿瘤免疫原性。在有关研究中，CDK4/6抑制剂联合程序化死亡受体1 (programmed death 1, PD-1)显著降低了肿瘤细胞的增殖，提高了致癌小鼠的存活率 [11] 。
3.3. CDK4/6抑制下诱导细胞衰老
有关研究表明，CDK4/6抑制剂阻止癌细胞生长、扩散外，抑制CDK4/6还可以触发癌细胞衰老 [13] 。这过程取决于RB和转录因子叉头框蛋白质M1 (forkhead box protein M1, FOXM1) [14] 。目前还不清楚CDK4/6抑制剂治疗癌细胞衰老程度的决定因素，有关研究发现，CDK4/6抑制剂(palbociclib)用剂量法阻止cyclinD1-CDK4/6复合物时，palbociclib从小剂量开始增加时发现细胞中RB依赖性活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平会逐渐提高，cyclinD1失活，同时发现自噬体表面蛋白(LC3B-II)显著增加、MDC自噬染色剂增多，当用抗氧化剂处理palbociclib处理的细胞中的ROS时，发现MDC和LC3B-II表达显著降低，这现象说明CDK4/6抑制剂通过使cyclinD1失活来诱导ROS，导致自噬机制激活，从而减轻乳腺癌细胞的衰老 [15] [16] 。
3.4. 提高肿瘤免疫原性
相关研究揭示了CDK4/6抑制剂如何作用于抗肿瘤免疫反应，不光影响癌细胞，也影响炎症微环境 [17] 。用Abemaciclib治疗乳腺癌的相关研究中发现，Abemaciclib诱导乳腺癌细胞停滞，但不会直接引起癌细胞凋亡，反而刺激细胞细胞毒性T细胞的能力，增强肿瘤免疫原性。这种情况是由于Abemaciclib治疗过程中刺激干扰素(IL-29，IL28a和IL28b)的基因表达和蛋白质分泌，由此加强了抗原呈递能力。研究中还发现，Abemaciclib显著降低了小鼠脾脏和淋巴结中调节性T细胞(Tregs)的数目，这可能与P21过表达引起的细胞周期抑制增强有关，同时还与DNA甲基转移酶1 (DNMT1)的能力降低有关 [17] 。
3.5. 调节细胞代谢
目前很多研究中发现了CDK4/6在细胞周期当中的很多作用，但这两种激酶在乳腺癌细胞代谢方面的作用尚不完全清楚，还在处于研究阶段 [13] 。相关研究表明，CDK4/6抑制剂使癌细胞中溶酶体和线粒体的数目增加，从而影响细胞代谢过程，进而诱导癌细胞凋亡 [18] 。
4. CDK4/6抑制剂的耐药机制
近几年CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的应用很普遍，国内国外指南上已被推荐为HR+/HER2−晚期乳腺癌一线治疗方案，但有关研究表明，CDK4/6抑制剂联合内分泌药物治疗一段时间后患者出现肿瘤复发现象，这表明CDK4/6抑制剂联合内分泌药物治疗后可能会影响CDK4/6抑制剂敏感性并允许肿瘤细胞恢复增殖，生长 [19] 。迄今为止，已经确定了耐药性发生的许多机制 [20] 。因此本文中以下几个方面总结了CDK4/6抑制剂耐药的分子机制。
4.1. 细胞周期特异性机制
4.1.1. 细胞周期蛋白D1-CDK4/6-RB途径
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是调控细胞周期的重要因子，此过程中CDK4和CDK6与D型细胞周期蛋白(cyclinD1)形成cyclinD1-CDK4/6复合物，进而磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(RB)。RB蛋白磷酸化导致腺病毒2区早期结合因子(E2F)的释放，其激活细胞周期从G1期到S期的转化。有关研究表明，在激素受体阳性乳腺癌患者中，内分泌治疗后耐药性的发生和发展与RB的功能和完整性有关。Dean等人的研究中表明，当RB表达阴性时，乳腺癌治疗效果对CDK4/6抑制剂不敏感 [21] 。此外，RB的功能也可以由E2F转录因子调节。在Malorni等人的研究中表明，E2F1和E2F2的表达都可能导致RB的缺失，并且有效的识别帕博西尼耐药和敏感的乳腺癌细胞 [22] 。
4.1.2. P16扩增
INK4 (inhibitors of CDK4)家族蛋白是CDK激酶的抑制子(CDKI)，能够结合并抑制CDK的活性。P16属于INK4家族，同时P16是CDK4的抑制因子，在细胞周期的调节中起着重要作用 [23] 。一般而言，P16通过抑制CDK4/6进而抑制RB从而阻滞细胞周期从G1到S期的进程，抑制细胞进行DNA合成来抑制细胞增殖。在乳腺癌中，P16可发生突变，从而失去其抑制功能，从而异常高表达。然而，P16扩增和RB的缺失是否在CDK4/6抑制剂发生耐药的机制中共同起作用尚不清楚 [24] 。
4.1.3. 细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)过表达
细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)是一组细胞周期调节蛋白，其控制细胞周期从G1期进入S期。因此细胞周期蛋白D1过度表达会造成细胞的异常增殖和分化，最终导致细胞的癌变。相关研究中揭示了在乳腺恶性肿瘤中发现了cyclinD1的过表达和基因扩增 [25] 。但是，目前还没有证实cyclinD1过表达是否与CDK4/6抑制剂耐药性相关的研究 [26] 。
4.1.4. 细胞周期蛋白E1 (CyclinE1)过表达
细胞周期蛋白E1 (cyclinE1)是细胞分裂过程中关键调节因子之一，它能够激活细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)，形成cyclinE1-CDK2复合物，进而磷酸化RB，磷酸化的RB释放E2F转录因子，使细胞周期从G1期进入S期，促进DNA复制。此过程的效率紧随cyclinD1-CDK4/6复合物之后，因此细胞周期蛋白E1-CDK2-RB途径的过度表达诱导对CDK4/6抑制剂的耐药性 [27] 。Turner等人的研究表明，较低的细胞周期蛋白E1的表达通常与改善帕博西尼在激素受体阳性乳腺癌中的疗效有关 [28] 。
4.2. 细胞周期蛋白D1-CDK4/6-RB旁路机制
4.2.1. 3-磷酸腺苷激酶ɑ (Pik3ca)突变
PIK3CA基因是一种细胞内发挥重要作用的蛋白质，它是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的关键组成部分，该通路在细胞增殖、分化和凋亡等过程中有关键作用。而PIK3CA基因主要作用是限制体细胞分裂，一旦发生突变，PIK3CA被异常的激活，导致相关蛋白过度表达，极大地影响相关酶的活性以及下游的信号通路，从而促使细胞发生癌变。在乳腺癌中，PIK3CA突变极为常见，仅次于TP53突变。目前，仅获批一款针对乳腺癌的PIK3CA药物(Alpelisib)，是一款PI3K抑制剂，能够抑制PIK3CA活性。有关研究表明，在HR+/HER2−晚期乳腺癌PIK3CA突变患者中使用PI3K抑制剂(Alpelisib)联合氟维司群会显著延长患者PFS，但由于PIK3CA突变、晚期、转移性乳腺癌等原因，该人群预后不良 [29] 。在肿瘤细胞没有获得耐药的情况下，PI3K抑制剂可以有效防止对CDK4/6抑制剂的耐药性。因此，CDK4/6抑制剂和PI3K抑制剂的组合会有效防止药物治疗的耐药性，同时加速肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤消退并改善患者病情 [30] 。
4.2.2. Hippo通路的改变
Hippo信号通路，又称“河马通路”，Gujral等人研究发现，Hippo信号通路与乳腺癌的发展和进展密切相关，已成为乳腺癌治疗耐药性的关键 [31] 。重要的是，Li等人的研究发现，Hippo信号通路改变与CDK4/6抑制剂耐药性有关，FAT1的缺失导致CDK6的显著升高，其抑制恢复了对CDK4/6抑制剂的敏感性，有FAT1突变患者PFS为2.4个月，无FAT1突变患者PFS为10.1个月 [31] 。CDK6的诱导是由FAT1通过Hippo信号通路介导，并在CDK6启动子上累积YAP和TAZ转录因子 [31] 。这些发现揭示了Hippo信号通路在乳腺癌的抑制作用，并证实了FAT1缺失和CDK4/6抑制剂的耐药性相关。
4.2.3. 成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR)通路的激活
在乳腺癌中，成纤维细胞生长因子受体(FGFR)分子改变可导致异常的FGF/FGFR信号，并与几种致癌行为有关，主要包括加快癌细胞增殖、分化、转移。Turner等人研究发现，在四种FGFR受体中，FGFR1扩增和过表达可能是导致激素受体阳性乳腺癌内分泌治疗(他莫昔芬)产生耐药的原因 [28] 。最近研究表明，FGFR1过表达诱导肿瘤细胞干性和ER介导的转录上调，这有助于解决内分泌治疗联合CDK4/6抑制剂(帕博西尼)治疗乳腺癌耐药产生的有关问题 [32] 。
4.3. 其他细胞周期蛋白和CDK相关的耐药机制
4.3.1. 雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)表达丧失
乳腺癌中，雌激素受体(estrogen receptor, ER)的激活是Cyclin-CDK4/6的主要驱动因素。选择性ER相关内分泌治疗有多种，例如，氟维司群联合CDK4/6抑制剂、他莫昔芬联合CDK4/6抑制剂以及芳香化酶抑制剂联合CDK4/6抑制剂等治疗方案已广泛应用于HR+/HER−晚期乳腺癌的治疗。相关研究中，细胞周期蛋白D1的表达水平可以通过ER来提高。因此CDK4/6抑制剂耐药性可能与由于ER表达丧失而导致的细胞周期蛋白D1降低有关 [33] 。例如，Gong等人的研究中，在CDK4/6抑制剂(Abemaciclib)耐药的临床前试验中，已观察到ER的表达丧失 [33] 。
4.3.2. 细胞质胸苷激酶1 (TK1)高表达
细胞质胸苷激酶1 (TK1)是一种细胞周期S期依赖酶，主要存在于细胞质中，参与DNA合成。乳腺癌中，TK1水平异常升高，因此，血清TK1水平高低的检测可用于乳腺恶性肿瘤的筛查及治疗后的疗效和预后价值 [34] 。Bonechi M等人研究表明，在CDK4/6抑制剂(帕博西尼)治疗HR+/HER−晚期乳腺癌的相关研究中，帕博西尼可以调节TK1的表达和活性，结果提示TK1可能是帕博西尼治疗有反应的早期反应物。因此，TK1活性的高表达所表明的肿瘤细胞增殖也是CDK4/6抑制剂早期耐药的标志 [34] 。
4.3.3. 自噬抑制(Autophagy Inhibition)
自噬一般看来是某种细胞存活的机制。自噬的激活诱导细胞周期G1期细胞停滞和衰老。相关研究表明，自噬与CDK4/6抑制剂耐药性之间存在相关性。例如，Vijayaraghavan S等人研究表明，CDK4/6抑制剂可以通过抑制细胞周期蛋白D1来激活自噬，从而抑制乳腺肿瘤细胞的增殖 [15] [35] 。
5. 结语
综上所述，CDK4/6抑制剂的开发为HR+/HER2−乳腺癌的精准治疗方面取得了突破性进展。但是治疗后出现耐药也是不可忽视的问题。尽管CDK4/6抑制剂耐药性相关的研究取得了一定的成果，但多种耐药机制需要通过系统的、全面的临床试验来解决，同时需要积极探索应对CDK4/6抑制剂耐药的新策略。因此，我相信未来有更多的临床研究及相关的临床试验会证实CDK4/6抑制剂出现的耐药机制，并做出更多应对的新策略，从而乳腺癌患者从最好的个性化治疗中获益。
NOTES
*通讯作者。