1. 引言
糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy, DPN)是糖尿病最常见的并发症，是一种以远端肢体感觉障碍、神经病理性疼痛为主要表现的慢性神经退变性疾病 [1] ，患者皮肤常有蚁行、麻木或放电等异常感觉，可能导致足部溃疡甚至截肢 [2] 。当前DPN西医治疗以降糖、改变生活方式和缓解神经性疼痛为主 [3] 。但存在缺乏特效药物、疗效不明确、不良反应大、药物成瘾性等诸多问题 [4] 。中药治疗DNP具有疗效显著、不良反应少的优势，可有效减轻麻木、疼痛等症状，延缓神经病变的进程 [5] [6] [7] 。
经络舒是贵州中医药大学第一附属医院内分泌科专家孔德明教授的经验方，该方由丹参、水飞蓟的提取物、三七粉3味药组成，经络舒宁胶囊是采用现代工艺提取有效部位制成的药物制剂，该制剂在长期临床使用中取得了一定效果，已作为糖尿病患者诊疗指南中的首选药物 [8] 。但经络舒宁治疗DPN的主要药物活性成分尚不明确，同时DPN发病机制复杂，经络舒宁作用多样性，有必要进一步系统分析经络舒宁对DPN的作用机制，寻找其发挥治疗作用的主要药效成分及作用途径。
本研究通过网络药理学收集经络舒宁的活性成分并进行靶点基因预测，再通过与DPN基因取交集后，进行富集分析，得到具有参考意义的作用靶点和通路，并对其进行动物实验验证，为后续经络舒宁治疗DPN的实验研究提供参考依据。
2. 材料与仪器
2.1. 动物
正常雄性SD大鼠，体重180~220 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK (湘) 2015-0003。
2.2. 药物与试剂
经络舒宁胶囊由贵州中医药大学药剂实验室自制；原方经络舒胶囊由贵州中医药大学药剂实验室自制；甲钴胺(弥可保)，卫材(中国)药业有限公司(批号：1411052)；高脂高糖饲料由贵州中医药大学药剂实验室自制，配方为普通饲料：蛋黄:白砂糖:猪油 = 55:15:15:15；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号：V900890)；柠檬酸(海化学试剂总厂，批号：20140209)；柠檬酸三钠(重庆川东化工有限公司，批号：20110601)；甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(T-CHO)测试盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒、糖化血红蛋白(GHb)测试盒均购置南京建成生物工程研究所(批号分别为：20150720、20150715、20150919、20150919、20150928)。
2.3. 仪器
Accu-Chek Performa卓越型血糖仪(罗氏诊断产品有限公司)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；PHS-3B精密pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)；AUY220型电子分析天平(日本岛津公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；YLS-3E型电子压痛仪(济南益延科技发展有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司生产)。
3. 方法
3.1. 经络舒宁治疗DPN的网络药理学研究
3.1.1. 经络舒宁有效成分及靶点获取
通过TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/)收集经络舒宁组方中药物化合物成分信息，设置筛选条件为生物口服利用度(OB) 30%，类药性(DL) 0.18，将三七、丹参和水飞蓟分别采用TCMSP数据库中查询，收集各药物有效化学成分，利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得SMILES并上传至Swissadme (http://www.swissadme.ch/)，以肠道吸收度(GI)为high，类药性分析条件3为标准，筛选出符合条件的成分 [9] 。将筛选的化合物的2D结构分子式上传至Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测，选择生物物种为homo sapiens，设定Probability > 10%，筛选后得到对应的靶点基因。
3.1.2. DPN靶标预测
利用Gene Cards (https://www.genecards.org)、OMIM (https://omim.org)、DisGeNET (https://www.disgenet.org)数据库，以“Diabetic Peripheral Neuropathy”为关键词获取DPN蛋白靶标，取三个数据库DPN蛋白靶标并集。
3.1.3. 成分–疾病交集基因的获取
运用Venn (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)数据库，获得上述结果中成分–疾病靶点的交集基因名称，即经络舒宁治疗DPN的潜在靶点。
3.1.4. 构建蛋白相互作用(PPI)网络构建
使用STRING在线数据库(https://string-db.org)，选择“Multiple proteins”搜索栏并设定物种信息为homo sapiens，上传药物疾病交集基进行分析，得到蛋白质–蛋白质相互作用网络(PPI)。将数据导入Cytoscape 3.8.2，筛选出核心靶点，设置节点为不同的颜色和形状使易于观察。
3.1.5. GO和KEGG通路富集分析
将获得的成分–疾病交集基因上传至Metascape在线数据库 (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，选择物种为homo sapiens分别进行GO注释分析和KEGG通路富集分析，预测经络舒宁治疗DPN的细胞组分、分子功能、生物过程及通路，并将Metascape数据库富集分析得到的分析结果导入微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)作图。
3.2. 经络舒宁治疗DPN药理学实验验证
3.2.1. 糖尿病模型制备和分组
SD大鼠普通饲料适应性饲养7 d后喂以高糖高脂饲料8周，禁食12 h，按照35 mg∙kg−1一次性左下腹部腹腔注射2% STZ溶液，72 h后用血糖仪测尾尖血随机血糖，随机血糖16.7 mmol∙L−1者视为造模成功 [10] [11] 。根据随机数字表按体质量、血糖将糖尿病大鼠分为5组：模型组、经络舒宁高、中、低剂量组及硫辛酸组，并设立正常组，每组10只。以体质量、鼠龄相匹配的正常大鼠10只作为正常组。
3.2.2. 药物制备及给药
周期各组大鼠自由摄食和饮水，连续干预12周。
3.2.3. 大鼠压痛值的测定
实验前将大鼠右后爪掌部作定点标记，置于安静环境中一段时间，将大鼠在压痛仪上测定压痛值，以大鼠出现嘶叫、后爪收缩等疼痛逃避反应为判定指标。
3.2.4. 大鼠甩尾温度阈值的测定
将大鼠宽松限制在鼠笼内，尾尖置恒温水浴箱内入水2 cm左右，初始水温38℃，以每分钟2℃加热升高水温，记录大鼠因水温升高甩尾而离开水面时的温度，即为甩尾温度阈值。
3.2.5. 功能学检测感觉神经传导速度(SNCV)测定
末次给药后，将大鼠麻醉，俯卧固定，暴露分离右侧坐骨神经。将刺激电极针置于足踝内侧胫神经处，将记录电极针置于坐骨神经尾椎端，SNCV设置单脉冲串刺激，刺激频次200，波宽0.01 ms，频率1 Hz，扫描速度1 ms∙D−1 (感觉)，电位20 μV∙D−1，滤波范围为2 Hz~10 kHz，刺激强度3.5 mA。记录感觉神经电位的潜伏期。计算SNCV，代入公式SNCV (m∙s−1) = 记录电极与刺激电极之间的距离(mm)/SNAP潜伏期(ms)。
3.2.6. 组织形态学观察
戊巴比妥钠麻醉成功后先腹主动脉取血，后将坐骨神经组织部分于4%多聚甲醛固定，部分于−80℃冰箱冻存待检。神经组织HE染色后，取固定后的神经组织，分别用梯度乙醇脱水，二甲苯浸渍、石蜡浸蜡后，进行包埋。石蜡切片(4 μm厚)脱蜡至水，根据试剂盒所提供步骤进行HE染色，中性树脂胶进行透明封片，光镜下观察大鼠神经组织形态结构改变。
3.2.7. 统计学分析数据
使SPSS20.0软件处理，数据以x ± s表示。多组对比采用单因素方差分析，数据满足正态分布及方差齐性，用最小显著性差异法(LSD)检验；满足正态分布，不满足方差齐性，用Dunnett’s t检验；不符合正态分布，采用多样本非参数检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
4. 结果
4.1. 交集基因的收集及“药味–成分–疾病”靶点网络的构建与分析
从TCMSP数据库筛选出三七有效成分8个，丹参有效成分65个，水飞蓟有效成分11个，去除重复共获得73个有效化学成分。以肠道吸收度(GI absorption)为high，类药性分析条件3为标准，在Swissadme数据库筛选出符合条件药物41个。设定Probability > 10%，三七、丹参和水飞蓟分别得到200、1687和169个作用靶点，去除重复后共有584个作用靶点。在Cytoscape 3.8.2软件构建的经络舒有效成分及作用靶点网络见图1，比较重要的成分的编号对应Mol ID和分子名见表1。
Figure 1. Network diagram of effective components and targets of Jingluoshu
图1. 经络舒有效成分及作用靶点网络图
Table 1. Mol ID and molecular name corresponding to the important effective components of Jingluoshu
表1. 经络舒重要有效成分对应Mol ID及分子名
利用在Gene Cards数据库，以“Diabetic Peripheral Neuropathy”为关键词，按Relevance score值从大到小排序后取中位数获取DPN蛋白靶标1869个。另外，在OMIM数据库中筛选出DPN相关靶点498个，在DisGeNET数据库中筛选出DPN相关靶点130个，取其并集，共筛选出符合要求的DPN疾病相关靶基因1869个，见图2。将从经络舒对应药物收集的584个作用靶点与DPN疾病1869个相关靶基因导入Venny在线平台分析后，得到交集基因共191个，如图2。
Figure 2. Component-disease target Venn diagram
图2. 成分–疾病靶点韦恩图
4.2. PPI网络的构建与分析
Figure 3. Component-disease intersection target PPI network diagram
图3. 成分–疾病交集靶点PPI网络图
将交集基因上传STRING数据库，获取成分–疾病靶点得PPI网络图，见图3。将PPI网络结果导入Cytoscape 3.8.2软件，得到节点190个，3337条边，经筛选后，得到核心靶点36个。按度值大小进行作图，设置度值越大的分子颜色越深，关联性越强，见图4。
Figure 4. PPI network diagram of component-disease core target
图4. 成分–疾病核心靶点PPI网络图
结果显示排名靠前的靶点是AKT1、PTGS2、MMP9和HIF1A等，这些靶点可能在经络舒宁治疗DPN疾病发挥作用。
4.3. 靶点GO和KEGG富集分析
Figure 5. GO enrichment analysis diagram of component-disease potential target
图5. 成分–疾病潜在靶点GO富集分析图
利用Metascape数据库对191个预测靶点进行GO功能富集分析，得到分子功能、生物过程和细胞组成的条目分别有1046、5830和523个。以gene count为筛选条件，取前10个富集基因作图。其中，P-value值越大，显著性越大，表示基因富集可能性越大。由图5可知，潜在靶基因参与的重要生物过程有醇基为受体的磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性和激酶结合等；重要细胞成分有膜筏、膜微区、外膜和细胞质核周区等，重要分子功能有激素水平调节、磷酸化正向调节、细胞–氮化合物反应和蛋白质磷酸等。
另外，利用Metascape数据库进行KEGG富集分析共得到200条通路。以Enrichment值为筛选条件，取前20个Enrichment值高的通路，以“Pathway”为纵坐标，以“Enrichment”为横坐标构建富集气泡图。气泡越大表示富集的基因个数越多，气泡颜色越绿表示P值越大，显著性越强。如图6，潜在靶点主要富集在Bladder cancer、EGFR、VEGF、AGE-RAGE和Type II等信号通路上，理论上验证了经络舒宁作用于机体后对于DPN能产生一定干预作用。
Figure 6. KEGG enrichment analysis bubble diagram of component-disease potential target
图6. 成分–疾病潜在靶点KEGG富集分析气泡图
4.4. 动物实验验证
4.4.1. 大鼠压痛值的测定
由图7可知，与正常组比较，其余各组大鼠压痛阈值均明显降低，差异具有显著性(P < 0.01或P < 0.05)；与模型组相比，各给药组大鼠压痛阈值均有不同程度的升高，其中经络舒宁高剂量组效果最优，与模型组相比具有显著性差异(P < 0.05)。
注：与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。
Figure 7. Comparison of tenderness threshold of rats in each group
图7. 各组大鼠压痛阈值的比较
4.4.2. 大鼠甩尾温度阈值的测定
由图8可知，与正常组比较，其余各组甩尾温度阈值均出现不同程度的上升，其中弥可保组升高幅度最小，且无显著性差异(P > 0.05)，说明该药对甩尾温度有良好的改善作用；与模型组相比，除经络舒低剂量组外，其余各给药组甩尾温度阈值与模型组比较均有显著性差异(P < 0.01)。
注：与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01。
Figure 8. Comparison of tail-flick temperature thresholds in each group of rats
图8. 各组大鼠甩尾温度阈值的比较
4.4.3. 经络舒宁对糖尿病大鼠坐骨神经SNCV的影响
注：与正常组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。
Figure 9. Comparison of sciatic nerve conduction velocity in each group of rats
图9. 各组大鼠坐骨神经传导速度比较
与空白组相比，模型组大鼠坐骨神经传导速度明显减慢，具有显著性差异(P < 0.01)，除经络舒低剂量组外各治疗组均可延缓坐骨神经传导速度的减慢，其中经络舒高剂量组疗效最好，与正常组相比无显著性差异(P > 0.05)，结果如图9。
4.4.4. 光镜观察坐骨神经形态的病理变化
正常组大鼠在给药8周后，坐骨神经组织经HE染色后排列有序，形态正常，神经纤维轴突与周围髓鞘均染成紫红色，轴索被染成深紫色，轴突外围有髓鞘包围，在髓鞘边缘紧贴髓鞘可见卵圆形的Schwann细胞核。模型组大鼠给药8周后坐骨神经可见明显的损伤变化，神经纤维排列紊乱，轴索萎缩甚至消失，髓鞘空泡变性，雪旺细胞减少。各给药组大鼠给药8周后坐骨神经也出现类似于模型组的病理变化，但均有不同程度的减轻，其中阳性弥可保组与经络舒宁高剂量组优于其他组。各组大鼠坐骨神经病理形态学改变见图10 (纵切HE × 40)。
注：(a) 正常组，(b) 模型组，(c) 阳性组，(d) JLS低剂量组，(e) JLS高剂量组，(f) JLSN低剂量组，(g) JLSN高剂量组。
Figure 10. Effects of Jingluoshuning on sciatic nerve histomorphology in diabetic rats
图10. 经络舒宁对糖尿病大鼠坐骨神经组织形态学的影响
5. 讨论
中医没有糖尿病周围神经病变这一具体病名，但关于其所表现出来的麻木不仁、疼痛等症状古代早已有记载。中医认为DPN最主要的辨证分型为瘀阻经络、气阴两虚 [12] [13] 。张欢等 [14] 认为阴虚为本、痰浊为标，瘀血贯穿始终是DPN的中医病因病机。经络舒宁组方中的三七具有活血止血、消肿止痛的功效 [15] 。明清时期，古人认为丹参功同四物汤，具有补血之功，但长于行血 [16] 。水飞蓟来源于菊科，可降血脂，能辅助治疗糖尿病及其并发症 [17] 。三药合用，可用于DPN的防治。
因此，本次实验利用网络药理学方法筛选出经络舒宁的活性成分及潜在靶点。其中三七和水飞蓟的共有成分槲皮素对应的疾病靶点较多。刘爱萍 [18] 发现四妙散中有效成分槲皮素对于治疗DPN疾病靶点是最多的。有研究发现，槲皮素能清除多余的活性氧，维持线粒体的功能，保护神经元 [19] 。因此，槲皮素可能是经络舒宁治疗DPN的关键成分。从成分–疾病核心靶点PPI网络图可以预测，AKT1和PTGS2是靶点为主要治疗基因靶点。AKT1又叫蛋白激酶B，参与细胞生长、分化、代谢、凋亡等生物学过程，有研究发现AKT1与胰岛素分泌、转运和调节糖原储存有关 [20] ，PTGS2是前列腺素内过氧化物合成酶，周围神经发生损伤时，可激活一系列炎症反应，导致神经细胞损伤和脱髓鞘，影响动作电位传导 [21] 。PTGS2能生成前列腺素，负向调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌，从而控制血糖 [22] 。通过对成分–疾病交集靶点进行KEGG富集分析，发现靶点主要富集膀胱癌、EGFR、VEGF、AGE-RAGE信号通路上，这几条通路都在DPN的治疗中发挥关键作用 [23] [24] [25] 。动物实验也证明，经络舒宁对糖尿病大鼠周围神经病变有一定防治作用。
总体上，本研究通过网络药理学初步筛选了经络舒宁治疗DPN的主要成分和核心靶点，初步阐明了涉及的主要生物过程及信号通路，从理论上验证了经络舒宁是通过多靶点、多成分、多通路的共同作用来发挥作用的，并通过动物实验验证了经络舒宁对糖尿病大鼠有一定对治疗效果。
基金项目
国家苗药工程技术研究中心能力提升，项目编号：黔科合中引地[2023] 006；贵州省高等学校中药民族药(苗药)新剂型新制剂工程研究中心，项目编号：黔教技[2022] 022；贵州省高层次创新型人才，项目编号：黔科合平台人才-GCC [2023] 037。
NOTES
*通讯作者。