1. 引言
蜱虫是一类分布广泛的媒介生物，可引起蜱媒传染病。蜱媒传染病是一类由媒介蜱传播、感染所引发的自然疫源性疾病 [1] 。蜱携带和传播的病原体种类数量繁多，包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体等，宿主动物分布广泛、流行环节复杂交错，且易受到自然环境和社会经济条件的影响 [2] [3] 。几种蜱传疾病往往共存于同一疫源地，一种媒介蜱也可同时携带两种或两种以上的病原体，这极大地增加了宿主动物及人类复合感染的机率，极易造成蜱传疾病的流行和暴发 [4] [5] [6] [7] 。
秦岭地处北纬32'~34'之间，介于关中平原和南面的汉江谷地之间，该地区自然资源丰富，生态系统物种繁多，地形复杂植被丰富，其独有的地理优势和独特的气候很适合蜱虫的生长和繁殖，因此秦岭地区就此成为蜱媒传染病的自然疫源地 [8] 。
2019年我们选取了蜱虫繁殖活跃的季节，对秦岭地区三个监测点：长安区、鄠邑区以及商南县的蜱虫携带病原体的情况进行调查研究，为秦岭地区的蜱媒传染病的流行病学研究提供依据，对秦岭地区蜱传疾病的防控具有一定意义。
2. 材料和方法
2.1. 材料
寄生蜱虫标本采集地点选取秦岭地区东段商南县、中段鄠邑区以及西段的长安区作为采集点，以三县位于山丘地去的农户家放养的羊、牛、犬作为研究对象，通过对家畜体表寄生蜱进行采集。
2.2. 方法
2.2.1. 蜱标本的采集
2019年5月~2019年8月以来我们在蜱虫活动高峰期进入采样点进行蜱标本的采集，并记录好采集地点的环境信息。主要采用动物体表检查的方法采集羊、牛、犬身上附着的寄生蜱。长安区124只，鄠邑区26只，商南县117只，共计采集267只蜱虫。
2.2.2. 蜱标本的保存与运输
对于在家畜体表采集到的寄生蜱标本，直接放入大塑料瓶中，做到编号和登记。将活蜱放入后再放入干滤的纸条，随后将标本送到实验室，将其放入4℃冰箱内进行保存。
2.2.3. 蜱虫标本拍照及形态学鉴定
对采集到的蜱虫标本用蒸馏水冲洗，再用75%乙醇固定，干燥后使用微生物电动视频检测系统对标本进行3D拍照，同时进行鉴定分类，之后放入−80℃超低温冰箱保存。
2.2.4. 蜱媒传播病原体DNA/RNA核酸提取
蜱虫标本病原体核酸的提取采用Qiagen All prep DNA/RNA Mini kit试剂盒操作过程如下：
1) 将每支装有蜱虫的EP管中加入3~4颗小钢珠，每管加入400 μl RLT，蛋白酶K 40 μl，放入细胞组织粉碎仪研磨；
2) 将EP管放入水浴55℃，10 min；
3) 全速离心，取上清入DNA柱，8000 g离心，30 s，离心套管内的滤液用来提取RNA；
4) 将DNA离心柱中加入500 μl Aw1，8000 g离心15 s；
5) 将DNA离心柱中加入500 μl Aw2，14,000 g离心20 min；
6) 离心柱放入新EP管中，加入100 μl EB，8000 g离心1 min；
7) 将套管内的滤液350 μl，加入等体积的350 μl 70%乙醇，将混合液放入RNA柱，8000 g离心15 s；
8) 加入700 μl RW1，8000 g离心15 s；
9) 加入500 μl RPE，8000 g离心15 s；
10) 加入500 μl RPE，8000 g离心2 min；
11) 加入50 μl RNase-free water，8000 g离心1 min。
收集提取的RNA和DNA放置于−80℃冰箱保存待检测。
2.2.5. 蜱媒传播病原体的PCR检测
对蜱虫携带的立克次体、无形体、巴贝西原虫、莱姆螺旋体、巴尔通体的检测采用巢式PCR的方法，针对新型布尼亚病毒采用Real-Time PCR的方法进行了核酸检测。选取各个病原体的高度保守区作为靶区域设计特异性引物，随后进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验，实验引物序列见表1。
1) PCR扩增检测以提取的DNA核酸为模板，分别进行两轮的巢式PCR扩增。扩增体系为25 μL，体系如下PCR Taq酶Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。第一轮产物作为第二轮模板，体系同上进行PCR扩增，对第二轮产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特定片段长短
Table 1. Primers and probe sequences used for pathogen detection
表1. 病原体检测所用引物及探针序列
对目的基因阳性进行标记记录。
2) Real-Time PCR检测以提取RNA核酸为模板，进行一步法的RT-PCR。扩增体系为20 μL，体系如下One Step RT-PCR Buffer 10 μL，Ex Taq酶0.4 μL，RT-Enzyme Mix 0.4 μL，ROX Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，探针引物0.8 μL，ddH2O 5.2 μL。
2.3. 统计分析
使用SPSS 20.0软件进行统计分析，不同地区的蜱虫病原体阳性携带率的差异使用卡方检验的方法，P < 0.05为有统计学意义。
3. 结果
3.1. 蜱种类鉴定
2019年5月以来我们在秦岭三个检测点共采集到蜱标本267只，其中长安区124只，鄠邑区26只，商南县117只。经鉴定采集到的蜱标本均为硬蜱科血蜱属长角血蜱，结果显示以上三个观察点的优势蜱种为长角血蜱。
蜱虫体长中等，无眼，有缘垛。假头短小，钝楔形。假头基为矩形，有明显的呈三角形的强大基突。须肢外缘向外侧中度突出，呈角状。雌虫盾板亚圆形，中部宽大，雄虫基突强大，末端尖。盾板上刻点中等大，分布均匀而较稠密。颈沟短小呈弧形。侧沟窄而明显。缘垛窄长而清晰。气门板为卵圆形(见图1)。
3.2. 媒介蜱标本感染病原体情况
我们对采集的蜱标本中的163只蜱虫标本通过PCR方法进行检测，发现蜱标本中立克次体阳性携带30只，阳性率18.40% (30/163)；嗜吞噬细胞无形体阳性携带100只，阳性率61.35% (100/163)；巴贝西原虫阳性携带1只，阳性率0.61% (1/163)；巴尔通体阳性携带4只，阳性率2.45% (4/163)；新型布尼亚病毒阳性携带5只，阳性率3.07% (5/163)；莱姆螺旋体经检测均为阴性。
3.3. 蜱虫地区分布差异情况
通过对秦岭三个地区蜱虫携带病原体阳性率进行统计分析，发现三个地区蜱虫携带病原体的阳性率均有差异(P < 0.05)。长安区蜱虫携带立克次体阳性率最高为35.00%，商南县次之，鄠邑区最低。噬吞噬细胞无形体的阳性率在鄠邑区最高，达到96.15%，商南县次之为62.39%，长安区最低为10.0%。巴贝西原虫只在商南县有检出，巴尔通体仅在长安区的蜱虫中检出，新型布尼亚病毒仅在商南县的蜱虫中检出(表2)。
Table 2. Tick pathogen carriage in different regions of the Qinling Mountains in 2019
表2. 2019年秦岭不同地区蜱虫携带病原体情况
3.4. 蜱媒传染病相关病原体混合感染情况
163只蜱虫中检出混合感染20只，混合感染率为12.27%。检出双重混合感染共有4种，包括立克次体与无形体混合感染、立克次体与巴尔通体混合感染、无形体与新型布尼亚病毒混合感染、无形体与巴贝西原虫混合感染。未见三重及以上多重混合感染情况。其中立克次体与噬吞噬细胞无形体混合感染最多为15只，混合感染率为9.20% (表3)。
Table 3. Mixed infection status of tick pathogens
表3. 蜱虫病原体混合感染情况
4. 讨论
蜱虫是第一种被认定为能够向人类传播病原体的节肢动物，是世界上仅次于蚊子的传染病传播媒介 [5] [9] 。蜱媒传染病是指病原体维持在自然周期中的人畜共患病，包括蜱媒和动物宿主 [10] 。不同的蜱种偏好不同的生物群落或环境，这决定了它们的地理分布，因此也决定了人类患蜱媒传染病的风险区域 [11] [12] 。畜牧区、野生动物栖息区、自然保护区、鸟类或者兽类栖息地等都是蜱虫分布的地方 [13] [14] 。随着当今社会发展，城市化进程加剧以及人口流动速度加快，导致了人员活动的范围在不断扩大，越来越多的人员进入自然保护区，势必会进入蜱媒传染病相关病原体的自然疫源地，从而变成蜱虫感染相关疾病的易感人群 [15] 。
本研究采集蜱虫267只，其中全部为长角血蜱，表明该地区媒介蜱的优势蜱种为长角血蜱。采用PCR的方法检测163只蜱虫，检出5种病原体，分别为嗜吞噬细胞无形体、立克次体、新型布尼亚病毒、巴尔通体以及巴贝西原虫。其中嗜吞噬细胞无形体阳性携带率最高为61.35%，其次依次为立克次体阳性率18.40%，新型布尼亚病毒阳性率3.07%，巴尔通体阳性率2.45%，最低的为巴贝西原虫阳性率为0.61%。我们的研究提示长角血蜱也是该地区蜱媒传染病主要传播媒介之一。
本次通过对秦岭地区蜱虫携带病原体进行检测调查，共发现了4种类型的双重混合感染，混合感染率为12.27%，研究显示最常见的混合感染为立克次体与噬吞噬细胞无形体混合感染。混合感染是指两种或两种以上的病原体同时或者先后侵入同一机体造成的共同感染 [16] 。我们知道蜱虫可以携带多种蜱传病原体，通过叮咬将这些病原体传染易感人群。而混合感染的病原体往往通过协同作用可以影响疾病的发生、发展以及预后，从而导致疾病不同的严重程度，影响临床治疗 [4] [15] 。
秦岭地区地形复杂、植被覆盖率高、生态物种丰富，是蜱媒传染病的自然疫源地。本次调查结果提示该地区蜱虫携带多种病原体，是人和动物诸多重要疾病的传播媒介，对进入该地区旅游或周边生活的人员存在潜在感染蜱媒的危害，因此有必要加强对这些蜱传疾病的防控。
NOTES
*通讯作者。