外泌体非编码RNA在非小细胞肺癌中的研究进展

Research Progress of Exosomal Non-Coding RNA in Non-Small Cell Lung Cancer

摘要: 非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居我国恶性肿瘤首位，患者5年生存率很低。越来越多的研究发现非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。外泌体ncRNA可参与转录调节、细胞增殖、凋亡等多个生物学过程。部分外泌体ncRNA在非小细胞肺癌中存在差异表达，有望成为NSCLC早期诊断的标志物。本文主要综述外泌体中的微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和环状RNA(circular RNA, circRNA)在NSCLC中的研究进展，探讨外泌体ncRNA作为早期诊断NSCLC新型标志物的临床应用价值与局限性。

Abstract: Non-small cell lung cancer (NSCLC) is one of the most common malignant tumors, with the highest mortality rate and the very low 5-year survival rate. More and more studies have found that non-coding RNA (ncRNA) plays an important role in the occurrence and development of tumors. Exosomal ncRNA can participate in many biological processes such as transcriptional regulation, cell proliferation, apoptosis and so on. Some exosomal ncRNA are differentially expressed in non- small cell lung cancer, which is expected to be a marker for the early diagnosis of NSCLC. This paper mainly reviews the research progress of microRNAs (miRNA), long non-coding RNA (lncRNA) and circular RNA (circRNA) in exosomes in NSCLC. To investigate the clinical application value and limitation of exosome ncRNA as a novel marker for early diagnosis of NSCLC.

1. 引言

2020年全球癌症统计报告数据显示，肺癌的发病率、死亡率分别位居全球癌症疾病谱的第2位和第1位 [1] ，临床上确诊的肺癌病例中80%~85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，且大于65%的患者被发现时处于肺癌晚期，预后较差 [2] 。根据NSCLC的病理学特征，可以细分为三个亚型：肺腺癌(Lung adenocarcino-ma, LAD)、肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LSCC)和大细胞癌(large cell carcinoma, LCC)，其中NSCLC的主要类型是肺腺癌和肺鳞癌，分别占NSCLC病人的50%和30% [3] 。目前NSCLC患者的的治疗策略主要集中在手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗以及免疫治疗等方面，根据患者的自身情况制定个体化的综合治疗方案。目前70%的患者在被确诊时已是晚期，且现阶段使用的治疗方法患者5年生存率尚不足15% [4] 。因此，提高患者5年生存率最重要的方法就是提高非小细胞肺癌的早期诊断率。

当前，临床上对于诊断NSCLC的主要手段方法包括X线检查、计算机体层成像(CT)、磁共振成像(MRI)、经支气管针吸活检术和经胸腔穿刺活检术等 [5] [6] 。X线检查可能会造成漏诊，且对病变的确切位置诊断存在一定困难；随着CT技术的日益成熟，对于NSCLC的检出率在逐步提高，但其准确率亟待提升；在MRI图像中无法显示肺的微观结构，并对肺内的钙化病灶不敏感；而经胸腔穿刺活检术并不适用于所有患者，且严重并发症的发生率可达24.45% [7] [8] [9] 。以上检查方法都存在着一定的局限性，因此，亟待寻找能够提高NSCLC检出率和特异性的方法。

由于外泌体(exosome)在细胞通讯中发挥着至关重要的作用，近年来来逐渐成为学者们争相研究的宠儿。非编码核糖核酸(Noncoding RNA, ncRNA)在转录调节、染色体复制、核糖核酸加工和修饰、mRNA的稳定和翻译以及蛋白质的降解和转运等方面具有重大意义 [10] 。因此，外泌体中的ncRNA可能成为早期诊断或提高NSCLC病人5年生存率的潜在标志物。本文将以NSCLC潜在标志物的非编码RNA在外泌体中的研究进展进行综述。

2. 外泌体与外泌体非编码RNA

外泌体是一种大小在30~100 nm之间细胞外膜样的杯状微形囊泡，普遍存在于体液中，主要通过体内大部分种类的细胞分泌，其来源于细胞内部的多泡体，通过胞吐作用后，被释放到细胞外的微环境中 [11] 。外泌体中的细胞成分较多，主要有DNA、RNA、脂类、代谢产物、胞质等，也含有多种细胞表面蛋白 [12] 。现在，主要使用以下七种方法：超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、商品化试剂盒沉淀法、亲和层析法、免疫磁珠法和微流控芯片法对外泌体进行提取和分离 [13] [14] 。表1归纳了几种外泌体分离方法的优缺点。

Table 1. Comparison of common methods of exosome extraction and isolation

表1. 外泌体提取和分离的常见方法对比

对外泌体进行鉴别的方法主要有以下三种：应用透射电子显微镜直接观察外泌体的形态，免疫学方法也就是通过流式细胞术、Western-blot、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等实验手段对外泌体表面特异蛋白CD9、CD63进行检测，以及纳米示踪分析技术(NTA) [15] [16] 。

非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)是指信使RNA (message RNA, mRNA)系列上除编码序列以外的其他序列，因此是不能作为翻译模板的非mRNA转录产物 [17] 。经过对非编码RNA形状、长度和功能的研究，学者们将其分为以下三个大类：环状RNA (Circular RNA, circRNA)，长链ncRNA (Long non-coding RNA, lncRNA)及小ncRNA (Small RNA, sRNA)。其中，由外显子–内含子circRNA、外显子circRNA和基因间circRNA组成的环状RNA，由于稳定性高，具有较强的表达特异性和保守性，被赋予较高的临床意义；lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的ncRNA，属于一种数量巨大的非编码RNA，其数量超过了全部RNA的80%；小ncRNA主要由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、微小RNA (miRNA)、与Piwi蛋白相作用的RNA (Piwi-interacting RNA, piRNA)等组成，在转录水平及转录后水平介导基因沉默等方面起着重要作用 [18] [19] [20] 。表2对部分外泌体ncRNA的一些生物学作用进行了归纳总结。

Table 2. Biological role of some exosomal non-coding RNA

表2. 部分外泌体非编码RNA的生物学作用

3. 外泌体ncRNA作为非小细胞肺癌生物标志物的研究

外泌体中含有大量可以发挥生物学功能的RNA，其中不具备编码功能的ncRNA数量大、种类多，主要包括：miRNA、lncRNA、circRNA等等。这些外泌体ncRNA可参与细胞相关的几乎所有生理或病理过程，其生物学功能包括抑制或促进肿瘤的生长和转移、参与细胞的分化和代谢等 [21] 。因此，研究外泌体ncRNA的功能，在疾病的预防、治疗、预后等方面具有重要意义。

3.1. 外泌体miRNA (exosomal microRNA, exo-miRNA)与NSCLC

微小RNA (miRNA)被学者定义为长度约19~22个nt的小分子ncRNA，其主要生理功能是参与调控生命的基本过程，比如器官组织的发生、发育成熟等，与此同时miRNA既可以作为抑制肿瘤的因子，也可以作为促肿瘤的因子 [22] 。目前已知的与细胞增殖、分化、凋亡、转移有关的miRNA大约有800~1000种，而与NSCLC癌细胞相关的miRNA约有40种，其中miR-21、miR-210和miR-184是目前已知与NSCLC癌细胞生长密切相关的外泌体miRNA。

miR-21是位于人类第17号染色体区域的微小RNA，高度保守 [21] ，在肺癌、胃癌、膀胱癌等大多数临床上常见的恶性肿瘤中表达异常 [23] 。He等 [24] 人经研究发现NSCLC患者血清中miR-21高表达，其作用机理可能是通过miR-21来抑制细胞的分化，并促使细胞向肿瘤细胞转变，从而提高癌症的发生率。Shen等 [25] 的研究发现，血清外泌体miR-21可通过不同的靶向分子调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。miR-21在NSCLC早期诊断中具有特定的价值，或被认为是NSCLC早期诊断的辅助指标。Li等 [26] 的研究显示，在NSCLC病人的血清中，miR-184的表达比正常人群要高很多，它在区分非小细胞肺癌的良恶性方面具有重要意义，并且与病人的预后有很好的相关性。Yang等 [27] 发现外泌体中的miR-210的表达水平与NSCLC细胞的迁移、增殖、入侵能力以及EMT的增加有明显的正相关，可通过PTEN/PI1K/AKT途径对NSCLC细胞的转移和入侵进行调节。上述研究提示，在NSCLC细胞外泌体中的miRNA可能作为诊断NSCLC的潜在标志物。

3.2. 外泌体lncRNA (exosomal lncRNA, exo-lncRNA)与非小细胞肺癌

LncRNA是一种线性的ncRNA，其长度大多超过200个核苷酸 [19] 。据人类基因数据库Human GENCODE的统计结果显示，人类基因组的lncRNA数量超过16000个。根据lncRNA基因在人类基因组上的定位，可分为5类：1) 位于基因间的一类lncRNA，称为lincRNA (Long intergenicRNA)；2) 反义链lncRNA；3) 正义链lncRNA；4) 位于内含子区的lncRNA；5) 双向lncRNA [28] 。Xian等 [29] 人在血清外泌体中发现一种全新的非编码RNA，即Linc01125。Linc01125能够起到竞争内源性RNA的作用，通过海绵化miR-3b-3p，提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白3 (Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 3, TNFAIP3)表达，从而抑制肿瘤生长和转移。因而血清外泌体linc01125是一种有希望的生物标志物，可用于无创诊断NSCLC和预测NSCLC的预后。Ling等 [30] 的研究显示，NSCLC患者血清中表达LncRNA RP5-977B1的新型外泌体对NSCLC早期诊断敏感性好，具有特异性，临床诊断应用潜力较大。外泌体RP5-977B1水平与NSCLC预后呈负相关，与肿瘤分期和远处转移相关，表明其具有基于血清的预后生物标志物的潜力。Talebi等 [31] 通过评估不同lncRNA在NSCLC患者的肿瘤组织、邻近非癌组织(Adjacent Non-Cancerous Tissue, ANCT)和外泌体中的表达发现，与ANCT相比，lncRNA-GHSROS、lncRNA-HNF1A-AS1和lncRNA-HOTAIR在外泌体的表达显著上调，而lncRNA-HMlincRNA717和lncRNA-P21在外泌体中表达下调，将肺癌特异性lncRNA与以上五种lncRNA组合检测，可提高NSCLC诊断的准确性。

3.3. 外泌体circRNA (exosomal circRNA, exo-circRNA)与NSCLC

circRNA是一种内源性ncRNA，在1976年Hsu等人 [32] 在Hela细胞质中发现了circRNA的表达。Xian等 [33] 在循环外泌体中鉴定出三种circRNA分别是：CIRC_0047921、CIRC_0056285和CIRC_0007761，对NSCLC早期诊断具有重要的意义。该研究发现，CIRC_0047921和CIRC_0056285在NSCLC患者血清中表达量减少，而CIRC_0007761的表达量明显增加。CIRC_004792可区分NSCLC患者和慢性阻塞性肺疾病患者，CIRC_0056285和CIRC_0007761可区分NSCLC患者和肺结核患者。此外，Zhang等 [34] 发现circSATB2在NSCLC细胞和组织中高表达，可能促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并且可能与NSCLC患者的淋巴转移有关。在NSCLC患者血清中，外泌体circSATB2检测的灵敏性和特异性高于非癌性样本，提示circSATB2可作为肺癌和转移性肺癌的外泌体生物标志物。circRNA在外泌体中含量丰富且稳定，在NSCLC早期诊断、预后等方面具有极大的临床前景和应用价值。

4. 外泌体ncRNA检测的应用价值与限制性

目前已有多项研究显示，外泌体ncRNA在NSCLC的早期诊断、治疗及预后中具有不可或缺的作用。NSCLC细胞可向其他细胞分泌含有特定ncRNA的外泌体，从而激活相关信号通路、促进新血管的生成，进而促进癌症的发生发展；其他细胞在接收NSCLC细胞分泌的外泌体同时，也可将外泌体分泌至NSCLC细胞，从而影响癌症的发生发展。外泌体作为遗传物质的有效载体，已成为研究NSCLC发病机制和最新研究技术的有力工具。然而，目前关于外泌体的研究尚存在局限性，首先，外泌体分离及鉴定方法虽然有多种，但每一种都有不同程度的局限，亟待进一步改善；再者，有关外泌体的发生释放等过程尚未完全揭示，对于新提出的分离检测方法还需反复验证、进一步完善；第三，现有的技术还需提高外泌体识别的分辨率、特异性和灵敏性，加速相关临床应用发展；第四，提高外泌体的回收率、降低损失，进一步保证含量高且能大批量分离外泌体。

5. 小结

NSCLC具有较高的发病率和死亡率，目前临床上主流的治疗方法包括化学药物治疗、放射治疗、外科手术、靶向治疗和免疫治疗等综合治疗，但要提高NSCLC患者的5年生存率仍有一定难度。液体活检技术是检测外泌体ncRNA的重要方法，外泌体ncRNA将成为NSCLC早期诊断、治疗及预后的关键生物标志物。尽管外泌体ncRNA与NSCLC的研究得到许多学者的关注，但目前发现的外泌体ncRNA基因仍较少，研究较局限，因此，未来还需要不断探索新的靶点或者标志物来突破NSCLC治疗瓶颈，提高NSCLC患者的生活质量。

致谢

行文至此，落笔为终。从论文的选题、资料的收集到论文的撰写完成，首先要感谢的是我的导师范晓航老师，范晓航老师严谨的治学态度和渊博的学识对我影响深远，笔短情长，师恩难忘！同时还要感谢我的朋友们，在学习工作中见证了我的喜怒哀愁，敬友谊长存，不离不弃，各自努力，高处相见。

基金项目

湖北省教育厅中青年人才项目(Q20182603)，湖北文理学院大学生创新创业项目(202110519007、X202110519015、X202310519068)，湖北文理学院博士科研启动经费资助项目(2059201)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。