1. 引言
心肌炎是由多种病因引起的心肌炎症,尤其是病毒感染,病毒感染引起的心肌炎被定义为病毒性心肌炎(VMC) [1] 。VMC会导致心力衰竭、心律失常,甚至心源性休克和死亡 [2] [3] 。然而,传统的诊断方法,包括血清心肌肌钙蛋白、心电图(ECG)、心脏磁共振成像(cMRI)和超声心动图,特异性和敏感性有限 [4] [5] [6] 。心肌活检是诊断心肌炎的金标准,但由于其对心脏的损害,在临床中的应用受到严格限制 [7] 。因此,迫切需要探索一种特异性和敏感性高的无创心肌炎诊断方法。
外泌体几乎可由所有细胞分泌,是通过向外出芽从质膜向外释放的直径约40~160 nm的细胞外囊泡,内部包含多种蛋白质及核酸成分,如mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等 [8] [9] 。外泌体富含于各种体液,由于具有双层结构,外泌体中的RNA可以免受RNA酶降解 [8] 。之前研究表明,circRNA在VMC中具有差异性表达 [10] ,但其含量在循环血液中较低且稳定性差,研究前景并不明朗 [11] 。近期有研究报道,外泌体具有保护心肌炎的作用 [12] [13] 。然而,目前尚不清楚哪个特定的外泌体成分具有保护功能。因此,本研究旨在探究外泌体circRNA对于AVMC的诊断价值及生物功能。
2. 方法
2.1. 入选病人及样本获取
于2021年7月至2023年3月在青岛大学附属医院采集9例AVMC患者外周血标本,同时采集9例健康对照标本。所有AVMC病例诊断参考2013年欧洲心脏病年会心肌炎诊断 [14] 。排除标准如下:冠状动脉疾病、瓣膜病、扩张型或肥厚型心肌病、先天性心脏病;自身免疫性疾病引起的心肌炎;以及接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗的AVMC患者。所有>18岁的患者均行冠状动脉造影或冠状动脉CT以排除冠心病的诊断。健康对照是年龄和性别与AVMC患者匹配的健康志愿者。AVMC患者的基本信息及临床特征见表1。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会(编号:QYFY WZLL 27489)批准,每位患者或其家长签署知情同意书。采集血样(10~15 ml)至EDTA抗凝管中。
Table 1. The basic information of AVMC patients
表1. AVMC患者基本信息
2.2. 外泌体分离
在4℃条件下,通过3步离心从人血浆中分离出外泌体。首先将血样4000 g离心15 min后收集上清。然后将上清液10,000 g离心30 min。最后将外泌体在100,000 g超离心70 min。最后将外泌体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬,100,000 g离心70 min,去除可溶性和分泌蛋白。应用Qiagen试剂盒法提取外泌体中的RNA。
2.3. RNA测序
提取好的外泌体RNA样本干冰运送,进行质检,在保证提取的RNA浓度和纯度合格的情况下,使用测序仪novaseq PE150对外泌体中的circRNA进行测序。利用R语言limma包的分位数算法进行原始数据归一化,以Fold Change绝对值大于2、P值 < 0.05作为截断值,初步筛选在AVMC中具有差异性表达且有统计学意义的circRNA。
2.4. 功能分析
GO、KEGG富集分析用于预测差异性表达的circRNA的潜在生物学功能及所参与的信号通路,通过R语言的clusterProfiler包进行费歇尔精确检验从而对差异性表达的基因进行分析。
Figure 1. The heat map of exosomal circRNA
图1. 外泌体circRNA热图
2.5. PCR实验
为了验证测序结果,我们选择了3个下调的circRNA对9对样本进行了qRT-PCR验证实验。cDNA的合成使用Vazyme HiScript II cDNA Synthesis逆转录试剂体系。qRT-PCR采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit试剂盒(Accurate Biotechnology,中国湖南)。β-actin作为血清外泌体circRNA定量的不变对照。2−ΔΔCT法测定相对表达量,所有的反应都进行了三次。circRNA引物序列如表2所示。
Table 2. The primer sequence for qRT-PCR
表2. qRT-PCR实验引物设计
2.6. 统计学方法
应用SPSS26.0软件包对资料进行分析,计量资料用均数 ± 标准差表示,两组的比较采用t检验;计数资料的比较采用卡方检验。P值 < 0.05视为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 外泌体cirRNA的差异性表达
采用高通量测序对AVMC患者和HC组各4份样本进行分析。热图(图1)和火山图(图2)显示,两组间外泌体circRNA存在表达差异。以P < 0.05和Fold Change绝对值 > 2为临界值筛选具有差异性表达的circRNA。总共筛选出1个上调和83个下调的外泌体来源的circRNA。表3显示了1个显著上调和10个最显著下调的外泌体circRNA。
Figure 2. The volcano plot of exosomal circRNA
图2. 外泌体circRNA火山图
Table 3. Top ten circrnas with down-regulated and up-regulated differences in exosome expression profiles of AVMC patients
表3. AVMC患者外泌体表达谱排名前十位下调和上调差异的circRNA
3.2. 功能分析
我们应用GO和KEGG富集分析来预测外泌体中差异表达的circRNA的潜在生物学功能。GO分析包括细胞成分、分子功能和生物过程三个部分。生物过程中,富集程度最高的GO分析条目是“上皮管形成”、“心室发育”和“心脏隔膜形成”。细胞成分中排名前三位的条目是“液泡膜”、“微管”和“溶酶体膜”。在分子功能方面,“ATP酶活动”、“GTP酶结合”和“微管结合”是三个富集程度最高的条目。同时,KEGG通路中“内质网蛋白质加工”、“血脂及动脉粥样硬化”和“人类免疫缺陷病毒感染”等条目富集程度最高。图3和图4显示了差异性表达的外泌体circRNA富集程度最高的GO和KEGG条目。
Figure 3. The GO analysis of circRNA in exosomes
图3. 外泌体circRNA GO分析
Figure 4. The KEGG analysis of circRNA in exosomes
图4. 外泌体circRNA KEGG分析
3.3. PCR实验
PCR结果显示,hsa_circ:97347314-97350555表达上调,hsa_circ:154033791-154034967 (hsa_circ_0001546)表达下调。两组间hsa_circ:88905209-88965915的表达水平差异无统计学意义。hsa_circ:154033791-154034967 PCR结果与测序结果一致,而hsa_circ:97347314-97350555的表达与测序结果相反。详细信息如图5所示。
Figure 5. The qRT-PCR experiment (*P < 0.05, ****P < 0.0001)
图5. qRT-PCR实验(*P < 0.05, ****P < 0.0001)
4. 讨论
根据WHO对心肌病的分类,心肌炎被定义为心肌的炎症性疾病 [14] 。心肌炎最常由病毒感染引起,可表现为急性心力衰竭、扩张型心肌病、心律失常,甚至心源性休克或心源性猝死 [15] 。然而,受限于现有的诊断工具,心肌炎的诊断相对困难,迫切需要特异性和敏感性良好的无创诊断方法 [4] [5] [6] 。此外,AVMC的调控机制尚未完全阐明。本研究首次证明血浆外泌体circRNA在AVMC中的差异表达谱和潜在功能。
AVMC的诊断具有挑战性,是一种排除性诊断 [16] 。AVMC与急性冠状动脉综合征、非缺血性心肌病、瓣膜病、心包炎等有相似的临床特征。这些疾病均可引起胸痛、胸闷等不适,肌钙蛋白、肌酸激酶等心肌酶升高,ST段偏离、Q波形成等心电图改变 [2] [3] 。然而,传统的诊断工具在特异性或敏感性方面受到限制。在过去的几十年里,cMRI已经成为一种安全、无创的诊断急性心肌炎炎症、水肿和坏死的工具。然而,由于cMRI成本高、便利性差,其临床应用也受到限制 [17] [18] 。心内膜心肌活检仍然是AVMC诊断的金标准,但由于其具有侵袭性损伤,其临床应用受到极大限制 [7] 。目前迫切需要寻找一种新的AVMC诊断生物标志物。
CircRNA是通过反向剪接(back-splicing)机制产生的,即RNA的3’端和5’端直接通过共价键结合,形成环状结构 [19] [20] 。有研究发现circHIPK2通过海绵性吸附miR-485-5p调控ATG101的表达,从而诱导自噬和细胞凋亡,加速心肌损伤 [21] 。在一些病毒感染中,circRNA与免疫反应之间的关系已逐渐得到证实。Y. Grace Chen等报道了核酸传感器RIG-I对circRNA的识别激活了先天免疫反应,并证实转染外源性circRNA的细胞增强了对病毒感染的保护作用 [22] 。我们的研究表明,AVMC患者和HC对照之间外泌体circRNA的表达谱存在显著差异。我们在外泌体中发现了84个具有显著差异的circRNA,其中1个上调,83个下调。之前有研究证实的病毒感染后反式作用蛋白因子90/110 (NF90/110)的核输出导致circRNA水平降低 [23] ,我们的研究结果与之是相吻合的。这些具有差异性表达的circRNA可能是AVMC潜在的诊断生物标志物,但其诊断价值有待进一步扩大样本量进行PCR验证。
研究发现,血清中circRNA在心肌炎患者中存在差异表达 [10] 。然而,游离circRNA在循环中是不稳定的,很容易被核糖核酸酶分解。外泌体在心血管领域引起了相当大的兴趣。外泌体的内容物包括蛋白质、脂质和RNA,在心血管疾病的发生发展中起重要作用。由于外泌体脂质双分子层对酶降解的保护作用,外泌体中存在的circRNA相对稳定。此外,外泌体具有良好的生物相容性,不会被巨噬细胞吞噬。外泌体广泛存在于各种体液中,如血液、唾液、尿液和脑脊液 [8] 。与游离circRNA相比,外泌体circRNA丰富了标本采集的途径,降低了采集标本的难度,这一点有待于在其他体液中进一步验证。
接下来,我们使用GO和KEGG富集分析来预测外泌体中差异性表达的circRNA的潜在生物学功能。富集最多的条目包括ATP酶活动、GTP酶结合、溶酶体膜、微管、内质网蛋白质加工。
综上所述,我们的研究结果首次证明了血浆外泌体circRNA在AVMC患者与HC之间存在差异性表达,可能具有潜在的诊断价值。此外,这些外泌体来源的circRNA可能具有一定的生物学功能,参与了AVMC的发病机制。然而,本研究存在一定的局限性。我们初步推测了血浆外泌体circRNA的潜在生物功能,外泌体circRNA在AVMC中的准确调控机制有待进一步研究。本研究筛选出的差异性表达的外泌体circRNA有待PCR实验进行进一步验证。
5. 结论
差异性表达的hsa_circ_0001546可能是AVMC的潜在诊断标志物;差异性表达的circRNA在AVMC中具有一定生物功能,可能参与AVMC的发病机制。
致谢
感谢所有参与研究的人员提供的宝贵数据,感谢褚现明教授的严格指导。
基金项目
本项研究由国家自然科学基金面上项目(82172574),山东自然科学基金面上项目(ZR2020MH016)及山东省高等医学教育研究中心科研规划课题(YJKT202171)支持。
NOTES
*通讯作者。