KDM5亚家族在胃癌中的作用及免疫浸润的初步分析

Preliminary Analysis of the Role of the KDM5 Subfamily in Stomach Adenocarcinoma and Immune Infiltration

摘要: 胃癌为全球范围内的重大恶性疾病，免疫治疗的出现极大改善了部分患者的预后，但仍有相当一部分患者表现出较差的治疗效果，故迫切需要新的生物标志物出现，本文旨在探究KDM5亚家族用于预测胃癌预后及免疫治疗的可能。我们的结果显示，KDM5B表达与患者预后呈负相关，ROC曲线(1年、3年和5年AUC分别为0.538、0.527、0.575)表明其对患者预后具有较强预测能力。KEGG和GO功能富集分析等显示其可能参与肿瘤的增殖、免疫逃逸、PI3K-AKT-mTOR、细胞铁死亡等生物过程，随后对免疫微环境的探究，发现KDM5B异常表达与免疫检查点LAG3 (P < 0.01)、PDCD1 (P < 0.01)表达差异具有明显相关性。总之，KDM5B可能作为胃癌的相关生物标志物，并可能作为一种新的免疫靶向手段作用于胃癌。

Abstract: Stomach Adenocarcinoma (or Gastric cancer) represents a significant global malignancy, and while the advent of immunotherapy has led to improved prognoses in some patients, a substantial pro-portion still experiences unfavorable treatment outcomes. Thus, there is an urgent demand for the identification of novel biomarkers. This study aims to investigate the potential utility of the KDM5 subfamily in predicting the prognosis of gastric cancer and its responsiveness to immunotherapy. Our findings revealed a negative correlation between KDM5B expression and patient prognosis. ROC curves demonstrated its robust predictive capacity for patient outcomes, with 1-, 3-, and 5-year AUCs of 0.538, 0.527, and 0.575, respectively. Functional enrichment analyses, including KEGG and GO, suggested its involvement in pivotal biological processes such as tumor proliferation, immune evasion, PI3K-AKT-mTOR signaling, cellular iron death, and others. Further exploration of the im-mune microenvironment unveiled a significant association between aberrant KDM5B expression and altered expression levels of immune checkpoints LAG3 (P < 0.01) and PDCD1 (P < 0.01). In summary, KDM5B holds promise as a pertinent biomarker for gastric cancer and a potential novel target for immune-based interventions in gastric cancer therapy.

1. 引言

胃癌(Stomach adenocarcinoma, STAD)为阻碍人类寿命延长的重大疾病之一，其总生存期短和不良预后一直是STAD治疗的难点，人类肿瘤基因组计划的完成与表观遗传学的进一步发展，极大改善了胃癌治疗的前景，但仍有相当一部分患者表现出较差的治疗效果，故迫切需要新的生物标志物，这需要对表观遗传学的更进一步的理解和对胃癌基因异常更准确的识别。

对表观遗传学的研究已成为STAD攻克过程中的重要方向，组蛋白参与真核生物染色体的组成，在甲基化、磷酸化、泛素化等重要修饰调节中发挥作用，组蛋白甲基化修饰是调控转录和染色质结构的关键修饰之一 [1] ，对其修饰机制的研究无疑是至关重要的。组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases, HMTs)与组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone demethylases, KDMs) [2] 同调节组蛋白甲基化维持动态平衡，若平衡失调则可能导致肿瘤发生；组蛋白赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)主要位于基因转录起始位点处，H3K4me3异常可与多种癌症的发生发展密切相关 [3] 。目前认为，H3K4me3修饰主要受甲基化酶KTM2A和去甲基化酶KDM5家族的共同调控。

KDM5亚家族包含四种利用Fe(II)离子和α-酮戊二酸去除H3K4me3甲基化的去甲基化酶 [4] [5] 。哺乳动物可编码KDM5A (JARID1A或RBP2)、KDM5B (JARID1B或PLU1)和KDM5C (JARID1C或SMCX)、KDM5D (JARID1D或SMCY) [6] 。现已证实KDM5家族异常在多种恶性肿瘤进展过程中具有重要作用，但在STAD中的详细探究仍较少。在此背景下，我们的研究集中在KDM5亚家族作为STAD有潜力的预后生物标志物探索，并讨论了与免疫细胞招募和浸润的关联因素。最终我们的结果表明，KDM5B可作为STAD的有吸引力的生物标志物，为STD的治疗提供新的靶向方案。

2. 材料和方法

2.1. 基因表达分析

KDM5亚家族泛癌表达数据来自于在线数据库The Cancer Genome Atlas (TCGA) database (https://portal.gdc.cancer.gov//, accessed on January 1, 2023)、Genotype-Tissue Expression (https://www.genome.gov//, accessed on January 1, 2023)。KDM5亚家族基因在STAD中的表达数据来自于the Assistant for Clinical Bioinformatics database (ACLBI, https://www.aclbi.com, accessed on January 1, 2023)。数据是公开可用并且是开放访问的，无需伦理委员会批准。

2.2. KDM5家族差异表达

通过TCGA和GTEx公共数据库获得包括STAD在内的33种常见恶性肿瘤的RNAseq数据和相应的临床信息；以Wilcoxon检验评估差异表达的统计学意义，P < 0.05为标准，通过R软件v4.2.1进行KDM5亚家族基因在泛癌中的表达差异分析，使用在线数据库ACLBI确定KDM5亚家族基因在STAD中的表达差异。

2.3. KDM5家族预后分析及变异分析

利用在线数据库ACLBI，根据基因表达中位数将STAD患者分为高表达组和低表达组，使用R包“survival、survminer”进行生存分析，log rank用于比较高表达组和低表达组之间的生存差异性，并使用R包“time ROC”计算患者1年、3年和5年生存情况，绘制时间相关的受试者工作特征(time-ROC)曲线以验证预测稳定性，得到最终预测对象KDM5B。通过cBioPortal在线数据库结合ACLBI数据库分析KDM5B基因组在STAD中的变异图谱，利用R包“maftools”可视化体细胞突变水平。

2.4. KDM5B富集分析及通路预测

从在线数据库GEO获得基因表达数据集，分析KDM5B在STAD中的差异共表达基因及其功能富集分析。R包“Limma”被用来研究mRNA的差异表达，Adjusted P < 0.05且|log₂倍数变化| > 1.5为阈值筛选mRNA差异表达超过1.5倍的共表达基因。R包“clusterProfiler”被用来进行基因本体论(Gene Ontology, GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG)的富集分析，利用在线数据库ACLBI，通过single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA)算法，获得基因与通路关系，最后结合STRING (https://string-db.org/)在线数据库预测KDM5B的蛋白质相互作用网络，P < 0.05被认为具有统计学意义。

2.5. KDM5B免疫环境分析

使用在线数据库ACLBI分析KDM5B与STAD各免疫细胞浸润及常见的8个免疫检查点的相关性，R包“haetmap、immunedeconv、ggplot2”R包绘制免疫细胞浸润情况，分析KDM5B与常见免疫检查点基因的相关性，wilcox检验用来对相关性进行支持，Spearman分析对相关性进行描述，P < 0.05认为具有统计学意义。

2.6. 统计分析

所有统计分析均采用R软件(版本4.2.1)，P < 0.05，认为结果有统计学意义。P < 0.01，认为结果有显著统计学意义。P < 0.001，认为结果有极显著统计学意义。

3. 结果

STAD患者KDM5亚家族的异常表达

基于33种常见恶性肿瘤中KDM5亚家族表达差异分析结果，可以清楚识别出部分肿瘤中KDM5亚家族表达水平较非肿瘤组织上调或下调，KDM5A、KDM5B、KDM5C在STAD中的表达水平显著上调(P < 0.001) (图1(A)~(C))，KDM5D于STAD中表达水平显著下调(P < 0.001) (图1(D))。随后进一步分析了KDM5亚家族基因在STAD中的表达水平，KDM5A、KDM5B、KDM5C在STAD组织中表达水平显著上调(P < 0.001)，STAD患者肿瘤组织和非肿瘤组织的表达对比中，KDM5D未展示出明显的差异性(P > 0.05) (图1(E))。

(A)~(D) KDM5亚家族在33种常见恶性肿瘤的异常表达。(E) 在STAD组织和非肿瘤组织中KDM5家族表达水平。红色代表肿瘤组织，蓝色代表非肿瘤组织。

Figure 1. Abnormal expression of the KDM5 subfamily in pan-cancer and gastric cancer

图1. KDM5亚家族在泛癌和胃癌中的异常表达

4. KDM5家族预后分析

使用数据库ACLBI，基于KDM5亚家族表达水平中位数将患者分为高表达组(n = 185)和低表达组(n = 185)，根据患者预后临床信息，以P < 0.05为标准绘制KM曲线，发现KDM5A、KDM5C独立预后指导意义(P = 0.933, P = 0.271)；而KDM5B则被发现与STAD患者总生存期呈明显负相关(P = 0.0343)，我们应用加权风险评分绘制了STAD患者KDM5B表达相关1年、3年和5年ROC曲线，在time-ROC曲线上，1年、3年和5年AUC数值分别为0.538、0.527、0.575，提示KDM5B具有较强预测预后的能力(图2(A)~(C))。随后我们进一步分析了KDM5B与STAD临床特征相关性，遗憾的发现KDM5B表达水平与性别(P = 0.8)、年龄(P = 0.19)不具有明显相关性，同时发现STAD患者中，KDM5B表达水平II期较III期差异具有统计学意义(图2(D)~(F))。

(A) KDM5A生存曲线。(B) KDM5C生存曲线。(C) 左侧为KDM5B基因表达与生存时间和生存状态的散点图、表达热图；右侧为KDM5B生存曲线及ROC曲线(1年、3年和5年AUC分别为0.538、0.527、0.575)。(D)~(F) KDM5B与STAD临床特征相关性。

Figure 2. Prognostic assessment of the KDM5 Subfamily

图2. KDM5亚家族预后分析

5. KDM5家族在STAD中的突变情况分析

通过cBioPortal公共数据库分析KDM5亚家族在STAD中的总突变情况，提示KDM5A、KDM5B、KDM5C在STAD中约7%、6%、6%基因改变发生率，KDM5D则相对较低，约为1.4% (图3(A))，且错义突变最为多见，我们进一步研究了KDM5亚家族在STAD不同亚型中的突变情况，绘制Mucinous Stomach Adenocarcinoma、Diffuse Type Stomach Adenocarcinoma等变异图谱，发现变异于Mucinous Stomach Adenocarcinoma最为常见(图3(B)~(E))。

(A) KDM5亚家族基因在STAD中的总突变情况。(B)~(E) KDM5家族基因在STAD不同亚型中的突变水平。

Figure 3. Mutation landscape of the KDM5 Subfamily in STAD

图3. STAD中KDM5亚家族突变景观

6. KDM5B在STAD中的突变景观

(A)~(C) KDM5B突变分布的Lollipop Chart、SNV频谱及Oncoplot。

Figure 4. KDM5B mutation profile

图4. KDM5B突变情况

结合数据库ACLBI，我们分析了KDM5B的突变情况，Lollipop Chart提示体细胞突变率约为4.3% (图4(A))，Oncoplot则显示了STAD的体细胞景观(331/372)，且错义突变最为常见(图4(C))，单核苷酸位点突变(Single Nucleotide Variant SNV) (图4(B))频谱提示碱基由C突变成T约占55.57% (52,101)，其次为T > C (17,315)、C > A (12,848)。

7. KDM5B差异基因富集分析及通路预测

从GEO数据库获得基因表达数据集，R包“Limma”筛选mRNA差异表达超过1.5倍的KDM5B共表达基因，得到上调基因1293个，下调基因18个(图5(A))，对差异基因进行了GO及KEGG功能富集分析，KEGG功能富集分析提示上调基因与PI3K-Akt signaling pathway、蛋白多糖、focal adhesion、人乳头瘤病毒感染有关。GO功能富集分析提示上调基因与细胞信号转导调控、GTPase活性的调控、细胞结组装、轴突生成有关(图5(B)~(C))。通过Spearman相关分析KDM5B与各生物通路相关性。以P < 0.05为界值，发现KDM5B表达与血管再生、细胞铁死亡、肿瘤炎症特征、PI3K-AKT-mTOR等42条生物通路相关(图5(D))。

(A) 共表达异常超过1.5倍基因的Volcano Plot。(B) (C) 共表达异常数值超过1.5倍的KEGG及GO功能富集分析。(D) KDM5B可能参与的生物通路。

Figure 5. Functional enrichment analysis of co-expressed genes with KDM5B and pathway prediction

图5. KDM5B共表达基因功能富集分析及通路预测

8. 蛋白–蛋白相互作用

KDM5B已被验证的PPI网络。

Figure 6. KDM5B protein-protein interaction network

图6. KDM5B蛋白作用网络

为进一步探索KDM5B异常和基因之间的关系，使用STRING数据库绘制与KDM5B具有最强蛋白–蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)的网络图。PPI网络包括11个基因节点和26个边缘(图6)，显示KDM5B的蛋白表达与KDM1A、TFAP2C及MYC等表达均密切相关。

9. KDM5B免疫景观

利用数据库ACLBI可视化KDM5B免疫评分情况，通过wilcox检验分析高表达组与低表达组中免疫细胞的差异性，结合免疫热图及箱型图可知二者激活记忆CD4+T细胞、B幼稚细胞、嗜酸性粒细胞、静息NK细胞、调节性T细胞差异表达具有统计学意义(P < 0.05)，激活NK细胞、M2型巨噬细胞差异表达具有明显统计学意义(P < 0.01)，CD8T细胞、B细胞记忆、静息记忆CD4+T细胞差异表达具有极明显统计学意义(P < 0.001) (图7(A)~(D))。随后我们分析两组样本中8个常见免疫检查点基因(SIGLEC15，TIGIT，CD274，HAVCR2，PDCD1，CTLA4，LAG3和PDCD1LG2)的表达情况，发现LAG3 (P < 0.01)、PDCD1 (P < 0.01)表达差异具有统计学意义(图7(E))，与各免疫细胞间的Spearman分析则提示(图7(F)) KDM5B与CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、NK细胞的表达具有明显相关性(P < 0.05)。

(A) (B) KDM5B免疫评分情况。(C) (D) 肿瘤浸润免疫细胞的百分比丰度差异。(E) 常见免疫检查点表达情况。(F) KDM5B与常见免疫细胞的相关性分析。红色代表KDM5B高表达，蓝色代表KDM5B低表达。

Figure 7. Immunological microenvironmental assessment of KDM5B

图7. KDM5B免疫微环境

10. 讨论

STAD是全球范围内发病率和死亡率均极高的恶性肿瘤之一，尤其是在亚洲地区 [7] [8] 。大规模测序数据结果为STAD中可操作和可用药靶点的识别提供了可能，但由于患者间和患者内基因组的异质性及STAD复杂的发生过程，通过靶向治疗改善患者的预后仍然有限 [9] [10] ，因此，挖掘新的STAD标志物已成为肿瘤攻克的前沿领域。STAD肿瘤标志物(tumor marker, TM)由肿瘤组织或宿主对肿瘤的反应产生，能够反映和监测STAD的发生、发展，对判断预后和复发具有重要价值。KDM5B参与转录调控和染色质形成的关键节点，这种特性使得其很适合作为生物标志物进一步探索。现已于前列腺癌 [11] 、乳腺癌 [12] 、肝细胞癌 [13] [14] 、胰腺癌 [15] 等多种人类恶性肿瘤中发现KDM5B异常表达，被认为与肿瘤转移、增殖、脂质代谢 [16] [17] 有关，随研究进一步深入，KDM5B被认为可能参与肿瘤侵袭、上皮–间质转化(EMT)、化疗耐药和DNA损伤修复过程 [18] [19] [20] ，但在STAD中的研究尚少，具有成为STAD治疗新靶点的巨大潜力。

我们的研究发现KDM5亚家族中KDM5A、KDM5B、KDM5C于STAD中表达水平显著上调(P < 0.01)，KDM5D未展示出明显的差异性；独立预后分析则提示KDM5B表达水平具有指导预后的可能性(P = 0.0343)，其表达程度与OS呈负相关，风险评分为1.429，KDM5A、KDM5C则可能不具备相关能力，随后在time- ROC曲线上，1年、3年和5年AUC分别为0.538、0.527、0.575证实KDM5B作为预测基因的稳定性。因肿瘤细胞所携带的突变基因会导致不受控制的细胞增殖和存活，我们进行了KDM5亚家族突变特征分析，发现Mucinous Stomach Adenocarcinoma错义变异最为常见，其中KDM5B具有6%基因改变的发生率，错义突变(C→T)最为常见，随后我们探究了KDM5B共表达基因的KEGG、GO功能富集分析发现，KDM5B的共表达基因与focal adhesion、趋化因子信号通路、淋巴细胞迁移趋化有关，黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种在癌细胞中过度表达的酪氨酸激酶，可导致癌细胞生长和增殖、减少炎症反应和免疫逃逸反应 [21] ，提示KDM5B可能与STAD增殖周期、迁移、免疫逃逸等相关。同时，KEGG功能富集分析明确共表达基因可能参与PI3K-Akt signaling pathway，PI3K信号通路参与到上皮–间质转化、凋亡、化疗耐药性和肿瘤转移等多种生物学活动中，有证据表明其显著参与STAD的发生发展过程 [22] ，GO功能富集分析提示共表达基因可能参与细胞信号转导调控、GTPase活性的调控有关，GTPase可直接或间接参与各种细胞需求过程，在调节细胞死亡和肿瘤免疫中同样具有重要作用 [23] ，后续的生物通路相关性结果同样支持我们的结论，此外，生物通路相关性分析提示KDM5B可能参与到细胞铁死亡(P = 0.001)的过程中，铁死亡是一种新的调节细胞死亡的形式，通常伴随铁的积累和脂质过氧化，自Scott J Dixon [24] 2012年首次提出以来，铁死亡已在胃肠道疾病领域取得了巨大的进展，学者们探讨了药物和基因在诱导铁死亡治疗STAD和解决耐药性 [25] 的机制，并对STAD中铁死亡与肿瘤微环境 [26] 的关系进行初步探讨，因此，KDM5B具有诱导铁死亡作为STAD治疗策略的临床应用前景。

PPI网络则提示KDM5B表达与KDM1A、TFAP2C及MYC等表达均密切相关(图6)，Ippei Nagamori [27] 发现结合H3K4去甲基化酶KDM1A和KDM5B的PIWIL4是去除H3K4me2标记所必需的，认为PIWIL4在组蛋白修饰的DNA甲基化中起重要作用；Ping-Pui Wong [28] 等人在近端启动子处发现了一个三元复合物，包含TFAP2C、癌蛋白Myc和组蛋白H3 (H3K4me3)去甲基化酶KDM5B。并进一步证明KDM5B依赖于其他两种蛋白同作用实现最佳CDKN1A阻遏，TFAP2C-KDM5B-Myc的沉默导致内源性启动子H3K4me3的增加和CDKN1A表达的完全诱导；Yiwei Li [29] 等人发现NEK2在STAD细胞系中高表达，并与促进细胞增殖、迁移和肿瘤生长有关，认为NEK2/β-catenin/Myc/KDM5B/H3K4me3信号通路可能是nek 2介导的STAD恶性行为的重要致癌因素。

考虑到预后与免疫因素具有一定的相关性，我们进一步分析了KDM5B在STAD免疫治疗中的可行性，发现CD4+T细胞、CD8+T细胞、激活NK细胞、M2型巨噬细胞表达差异具有统计学意义，活化的T细胞、NK细胞、B细胞可表达淋巴细胞激活基因-3，又名CD223 (LAG-3)，LAG-3被认为是癌症治疗发展中仅次于PD-1的首要靶标，并且测试LAG-3靶向治疗的功效的多个临床试验正在进行中 [30] ，活化的T细胞可表达程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1或CD279 (分化簇279)，人PD-1蛋白由PDCD1基因编码，LAG3、PDCD1均为免疫检查点受体蛋白，提示KDM5B异常可能激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞表达启动免疫检查点，进而启动肿瘤的免疫进程。复杂的免疫交联机制，也可能是STAD治疗效果较差的重要原因之一，对未来STAD的研究将起到重要规导作用。

总而言之，我们的研究补充了KDM5亚家族在STAD研究中的不足，认为KDM5B与STAD预后负相关，具有作为潜在生物标志物的可能，免疫景观分析也为STAD的靶向治疗提供了可能方向，然而，值得注意的是，我们的研究尚存在一定的局限性，首先我们的数据信息均来源于TCGA、BioPortal、GTEx、STRING公共数据库，因此我们的研究过程及结论仅适用于上述数据库。其次，缺乏一定数量的组织或者细胞层面结果对我们的结论形成支持，因此，KDM5B可能为STAD临床治疗新靶点的发现提供一定的理论依据，但具体功能及机制仍有待进一步验证。

NOTES

^*通讯作者。