摘要: 目的：通过meta分析研究MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G三个位点基因多态性与不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的相关性。方法：通过检索数据库PubMed、EMBASE及Web of Science，共检索到953篇文献，其中PubMed 213篇、EMBASE 439篇、Web of Science 301篇，通过阅读文献，按照筛查标准进行初筛，最终共纳入43篇文献进行meta分析。结果：Meta分析提示叶酸代谢酶MTHFR、MTRR基因的三个位点的基因突变率(MTHFR C677T位点CC vs. CT + TT、A1298C位点AA vs. AC + CC、MTRR A66G位点AA vs. AG + GG)在URSA组与对照组之间存在显著差异(P < 0.05)。对于MTHFR C667T CC vs. CT + TT组，共纳入35篇文献，合并后的OR = 1.21，95% CI [1.10~1.34]，对于MTHFR A1298C AA vs. AC + CC组，共纳入14篇文献，合并后的OR = 1.18，95% CI [1.04~1.35]，对于MTRR A66G AA vs. AG + GG组，共纳入3篇文献，合并后的OR = 1.52，95% CI [1.19~1.94]，即URSA病例组MTHFR C677T基因位点、A1298C基因位点和MTRR A66G基因位点的突变率显著高于对照组。结论：本meta荟萃分析结果提示MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因的A66G位点与叶酸代谢有关。
Abstract:
Objective: To investigate the correlation between genetic polymorphisms at three loci of MTHFR gene C677T, A1298C, and MTRR gene A66G and unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) through meta-analysis. Method: By searching the databases PubMed, EMBASE, and Web of Science, a total of 953 articles were retrieved, including PubMed 213 articles, EMBASE 439 articles, and Web of Science 301 articles. After reading the literature, preliminary screening was conducted according to screening criteria, and a total of 43 articles were included for meta-analysis. Result: Meta-analysis showed that the mutation rate of three loci of MTHFR and MTRR genes (MTHFR C677T locus CC vs. CT + TT, A1298C locus AA vs. AC + CC, MTRR A66G locus AA vs. AG + GG) was significantly different between URSA group and control group (P < 0.05). For the MTHFR C667T CC vs. CT + TT group, a total of 35 articles were included, with a combined OR of 1.21, 95% CI [1.10~1.34]. For the MTHFR A1298C AA vs. AC + CC group, a total of 14 articles were included, with a combined OR of 1.18, 95% CI [1.04~1.35]. For the MTRR A66G AA vs. AG + GG group, a total of 3 articles were in-cluded, with a combined OR of 1.52, 95% CI [1.19~1.94], which is the MTHFR C677T gene locus in the URSA case group. The mutation rates of A1298C gene locus and MTRR A66G gene locus were significantly higher than those of the control group. Conclusion: The results of this meta-analysis suggest that the C677T and A1298C loci of the MTHFR gene and the A66G locus of the MTRR gene are related to folate metabolism.
1. 引言
复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是导致妊娠失败的常见生殖障碍性疾病，严重影响育龄期妇女的身心健康，作为辅助生殖领域亟待解决的重要问题，也受到很多学者和专家的关注。国内专家认为RSA是指既往与同一丈夫连续发生≥2次妊娠28周内的妊娠丢失 [1] 。英国皇家妇产科学院(Royal College of Obstetricians and Gynaecologists, RCOG) 2011年对于RSA的定义是：与同一配偶连续发生≥3次妊娠24周之前的妊娠丢失，包括生化妊娠流产 [2] 。美国生殖医学学会(American Society for Reproductive Medicine, ASRM) 2012年关于RPL定义是：与同一配偶发生≥2次宫内妊娠丢失，未明确孕周上限，并明确指出排除生化妊娠流产。欧洲人类生殖与胚胎学会(European Society of Human Reproduction and Embryology, ESHRE)在2017年将RSA定义为：与同一配偶发生≥2次妊娠24周之前的妊娠丢失，并且包括生化妊娠流产。目前已经有研究发现，连续发生2次自然流产与连续发生3次自然流产的病因构成比相近，且发生2次自然流产后再发自然流产的风险较高 [3] 。充分结合国内外的研究情况和我国的社会背景，我国2022年最新专家共识将RSA定义为：与同一配偶连续发生≥2次妊娠28周之前的妊娠丢失，包括生化妊娠流产 [4] ，强调流产的连续性和重视流产的再发风险。目前，国内外对RSA的次数、孕周上线、是否包括生化妊娠、流产是否连续等方面统一的国际标准还没形成共识。大多数国家和地区对RSA的定义是根据当地的经济、环境、社会因素和背景制定的。RSA的发生对生育期育龄妇女的心理、生理、机体生殖功能等造成巨大伤害，给母婴健康安全带来了很大威胁。RPL病因和发病机制复杂，主要包括染色体异常、子宫解剖异常、内分泌异常、免疫异常等。除外上述已知的明确病因外，仍有40%~50%以上的RSA患者未发现明确致病因素，被称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA) [2] 。近年来关于MTHFR、MTRR基因代谢与RSA，尤其是URSA的相关性研究较多，但尚无定论。基于不同种族、地域、样本选择的偏差，研究方法的差异及RSA的影响因素复杂多样，叶酸代谢相关基因与URSA的相关性研究结果亦有不同。本研究通过检索，共检索到953篇文献，通过筛选，最终的meta分析共纳入43篇文献，在宏观上对MTHFR、MTRR基因多态性与不明原因复发性流产的相关性进行综合分析。
2. 资料及方法
2.1. 一般资料
所纳入的文献其主要研究是针对病例组和对照组中MTHFR C677T、A1298C和MTRRA66G的各个基因位点的多态性基因型的频率等进行对照研究。
2.1.1. 纳入标准
1) 文献类型为病例对照研究；2) 病例组人群为不明原因复发性流产患者；3) 复发性流产的定义为既往与同一丈夫连续发生≥2次妊娠28周内妊娠丢失；4) 对照组人群为既往正常生育过健康孩子且无不良孕产史；5) 研究MTHFR C677T、A1298C及MTRR A66G三个位点。
2.1.2. 排除标准
1) 夫妻双方或任一方染色体核型异常、子宫解剖异常、内分泌异常、免疫异常等；遗传或获得性易栓症；2) 动物类实验；3) 重复发表的文献；4) 未明确不明原因复发性流产的定义；5) 会议摘要、个案报道、个人通信等。
2.2. 文献检索及筛选
检索的数据库为PubMed、EMBASE及Web of Science，检索策略为主题词与自由词相结合，检索词包括：Recurrent pregnancy loss、Recurrent abortion、Recurrent spontaneous abortion、Habitual Abortion、Habitual Abortions、Abortion、Recurrent、Recurrent Abortion、Recurrent Abortions、Miscarriage、Recurrent、Recurrent Miscarriage、Recurrent Miscarriages、Recurrent Early Pregnancy Loss、Methylenetetrahydrofolate reductase、MTHFR、Methionine synthase reductase、MTRR等。将上述三个数据库所检索到的文献导入EndNote进行筛选，先去除三个数据库中重复的文献，之后按照既定的纳、排标准，浏览标题及摘要进行初筛，剩下的文献查阅全文，符合要求的文献纳入最终的meta分析。
2.3. 数据提取
数据提取主要为MTHFR C677T、A1298C和MTRRA66G的各个基因位点的基因突变率。从原文中提取研究人群的基本特征及结果数据，主要包括第一作者、发表年份、国家、样本量、复发性流产的定义(是否为不明原因、流产次数、是否为连续流产、是否与同一伴侣)、检测标本的类型及病例组和对照组中MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRRA66G的各个基因型的频率等。
2.4. 统计学处理
统计分析采用Stata 16，MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因多态性与不明原因复发性流产的相关性以OR值及其95% CI表示。组间比较的设定为MTHFR C677T CC vs. CT + TT、MTHFR A1298C AA vs. AC + CC、MTRR A66G AA vs. AG + GG。使用星状图、Q检验、I2评估异质性。I2值越高，异质性的风险越大。当I2 ≥ 50%时，存在显著的异质性。当I2 ≤ 50%时，采用固定效应模型进行meta分析。当I2 ≥ 50%时，可通过星形图和敏感性分析确定异质性来源，或采用随机效应模型进行meta分析。绘制漏斗图，分析纳入文献的偏倚。采用敏感性分析来评估meta分析结果的稳定性，即对所纳入的文献进行逐一剔除，观察剔除每一篇文献之后的异质性及效应量的变化，从而判断最终结果的稳定性。
3. 结果
3.1. 文献筛选结果
通过检索，共检索到953篇文献，其中PubMed 213篇、EMBASE 439篇、Web of Science 301篇，导入EndNote后，去除重复文献323篇，通过阅读标题及摘要对剩下的630篇文献进行初筛，排除508篇，对剩余的122篇进一步查阅全文，其中无法获得全文为14篇，会议摘要为12篇，无所研究的结局指标为27篇，研究人群是非不明原因复发性流产的为26篇。最终的meta分析，共纳入43篇文献。文献筛选流程图如图1所示。
Figure 1. Literature screening flowchart
图1. 文献筛选流程图
3.2. 文献质量评价
纳入文献的质量评价，16篇文献得分为9星，17篇文献得分为8星，8篇文献得分为7星，2篇文献得分为6星，见表1。
Table 1. Newcastle-Ottawa quality assessment form
表1. Newcastle-Ottawa质量评估表
3.3. 异质性检验
对于MTHFR C677T CC vs. CT + TT组，经过异质性检验，I2 = 69.9%，Q检验P < 0.001，提示本次纳入的文献存在明显的异质性，且具有统计学意义，故绘制星状图查找异质性的来源，提示有8篇存在异质性的可能性较大，见图2。去除上述文献之后，再次进行异质性检验，I2 = 0.8%，Q检验P = 0.455，异质性较小，故采用固定效应模型进行meta分析。
对于MTHFR A1298C AA vs. AC + CC组，经过异质性检验，I2 = 89.8%，Q检验P < 0.001，提示本次纳入的文献存在明显的异质性，且具有统计学意义，故绘制星状图查找异质性的来源，提示有10篇存在异质性的可能性较大，见图3。剔除上述文献后，再次检验异质性，I2 = 0%，Q检验P = 0.585，说明不存在异质性。因此，采用固定效应模型进行meta分析。
对于MTRR A66G AA vs. AG + GG组，经过异质性检验，I2 = 0%，Q检验P = 0.752，提示本次纳入的文献不存在异质性，采用固定效应模型进行meta分析。
Figure 2. Star plot of MTHFR C667T CC vs. CT + TT
图2. MTHFR C667T CC vs. CT + TT的星状图
Figure 3. Star plot of MTHFR A1298C AA vs. AC + CC
图3. MTHFR A1298C AA vs. AC + CC的星状图
3.4. Meta分析结果
对于MTHFR C667T CC vs. CT + TT组，共纳入35篇文献，合并后的OR = 1.21，95% CI [1.10~1.34]，提示两组间MTHFR C667T突变率有统计学差异，URSA组的突变率比对照组高，见图4。
Figure 4. Forest map of MTHFR C667T CC vs. CT + TT
图4. MTHFR C667T CC vs. CT + TT的森林图
对于MTHFR A1298C AA vs. AC + CC组，共纳入14篇文献，合并后的OR = 1.18，95% CI [1.04~1.35]，提示两组间MTHFR A1298C突变率有统计学差异，URSA组的突变率比对照组高，见图5。
Figure 5. Forest map of MTHFR A1298C AA vs. AC + CC
图5. MTHFR A1298C AA vs. AC + CC的森林图
对于MTRR A66G AA vs. AG + GG组，共纳入3篇文献，合并后的OR = 1.52，95% CI [1.19~1.94]，提示两组间MTRR A66G突变率有统计学差异，URSA组的突变率比对照组高，见图6。
Figure 6. Forest map of MTRR A66G AA vs. AG + GG
图6. MTRR A66G AA vs. AG + GG的森林图
3.5. 发表偏倚分析
绘制漏斗图评估发表偏倚，如图7~9所示。
Figure 7. Funnel diagram of MTHFR C667T CC vs. CT + TT
图7. MTHFR C667T CC vs. CT + TT的漏斗图
Figure 8. Funnel diagram of MTHFR A1298C AA vs. AC + CC
图8. MTHFR A1298C AA vs. AC + CC的漏斗图
3.6. 敏感性分析
逐一剔除每一篇文献后，OR值及其95% CI变化不大，提示该研究结果稳定性较好，见图10、图11。
Figure 9. Funnel diagram of MTRR A66G AA vs. AG + GG
图9. MTRR A66G AA vs. AG + GG的漏斗图
Figure 10. Sensitivity analysis of MTHFR C667T CC vs. CT + TT
图10. MTHFR C667T CC vs. CT + TT的敏感性分析
Figure 11. Sensitivity analysis of MTHFR A1298C AA vs. AC + CC
图11. MTHFR A1298C AA vs. AC + CC的敏感性分析
3.7. 结论
本meta荟萃分析结果提示：MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因的A66G位点与叶酸代谢有关。URSA组与对照组间MTHFR C677T CC vs. CT + TT、MTHFR A1298C AA vs. AC + CC、MTRR A66G AA vs. AG + GG的突变率差异有统计学意义(P < 0.05)。即URSA病例组MTHFR C677T基因位点、A1298C基因位点和MTRR A66G基因位点的突变率显著高于对照组。
4. 讨论
目前，叶酸代谢酶MTHFR、MTRR在生殖健康领域越来越受到关注。对于围孕期的育龄夫妇，尤其是对于有不良妊娠史的夫妇而言，叶酸代谢相关基因位点多态性可能影响生育状况，但尚无明确结论。叶酸代谢酶的基因多态性，特别是MTHFR、MTRR与URSA的相关性研究结论各异。叶酸代谢关键酶MTHFR、MTRR基因发生位点突变后，突变基因型对应的酶活性降低，影响叶酸的吸收和代谢，例如MTHFR C677T位点TT纯合突变与HHCY血症有关 [5] ，可能增加不良孕产的发生风险 [6] 。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因位于人类1号染色体，位置在1p36.3段，包括11个外显子和10个内含子 [7] 。MTRR基因位于人类第5染色体P15.2~15.3 [8] 上，包含15个外显子。叶酸代谢酶MTHFR的活性和热稳定与基因型组成相关，不同基因型酶活性不同，叶酸的代谢活性随之改变 [9] 。据报道MTHFR基因A1298C (AC或CC)对应的酶活性为野生型(AA)的78%； C677T CT基因型对应的酶活性是野生型(CC)的65%，而TT基因型对应的酶活性只有野生型的30%。叶酸代谢酶MTRR基因的变异位点是A→G的多态性，酶活性降低与基因型有关，酶活性降低可造成HCY累积 [10] 。MTHFR、MTRR基因突变均导致酶的活性改变，从而引起活性甲基(一碳代谢)代谢障碍，进而影响HCY代谢，使多种疾病的发病几率增加 [11] 。MTRR基因A66G GG、AA基因型对应的酶活性分别是野生型的30%、65% [12] 。
叶酸代谢酶MTHFR和MTRR在叶酸代谢过程中发挥着重要作用，其基因多态性可导致叶酸的代谢、转化、利用障碍和体内HCY高水平 [13] 。万波等认为母亲HHCY与HDCP、GDM、胎盘血管病变、早期复发性流产(early recurrent spontaneous abortion, ERSA)有关 [14] 。叶酸代谢路径中相关的酶，以及酶的基因多态性与新生儿出生缺陷(Birth defects, BD)有密切联系 [15] ，其原因可能是体内过高的HCY代谢障碍、DNA合成障碍、DNA低状态的甲基化反应或甲基化反应异常，从而引起不良妊娠及结局的发生。孕妇缺乏叶酸会增加NTDs的风险 [16] ，同时其他出生缺陷的发生率也会上升，如唐氏综合征(Down syndrome, DS)、唇裂(cleft lip, CL)、腭裂(Cleft palate, CP)、先天性心脏病(Congenital heart disease, CHD)等 [17] 。叶酸在体内发挥着重要功能，孕期妇女叶酸缺乏是NTDs发生的主要原因 [18] 。临床上已经把备孕期、孕期补充叶酸作为预防出生缺陷的重要措施。班彦杰等 [19] 认为MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因突变是URSA的危险因素。丁娇等 [20] 认为叶酸代谢紊乱的异常基因检测和高HCY是URSA发生的重要危险因素。根据中国张丹等 [21] 的meta分析，MTHFR C677T基因多态性与URSA的发生率显著相关，是URSA的独立遗传危险因素。杨俊 [22] 等人研究认为MTHFR C677T位点C/T位点基因纯合、杂合变异是RSA发生重要因素，而MTHFR A1298C位点多态性与RSA的发生未发现相关性。Luo L [23] 等认为MTHFR 677T等位基因和677T、1298A可能会增加URSA的风险。
但也有研究未能证明MTHFR基因多态性与RSA的关系 [24] 。白微 [25] 等研究发现叶酸代谢酶MTHFR基因位点C677T多态性未发现与URSA存在相关性。李伏福 [26] 等人研究认为MTHFR基因A1298C位点、MTRR基因A66G位点多态性与URSA未发现有明确的关系。戚桂杰 [27] 等人研究发现叶酸代谢酶MTHFR基因位点A1298C和MTRR基因位点A66G与URSA无关。Ren A, Wang J [28] 等认为除中国人外，MTHFR C677T突变不是URSA的遗传危险因素。Wu X [29] 等人以高加索地域或欧洲地域人群作为纳入对象，采用总体Meta分析或亚组Meta分析得出结论，MTHFR C677T基因多态性与URSA风险之间无显著相关性。Krause [30] 等研究认为，叶酸代谢酶MTHFR基因多态性未发现有地域差异性。
目前研究者的研究结论不尽相同，然而MTHFR、MTRR酶基因多态性引起流产的机制仍是该领域的研究热点。本研究结果表明MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G三个位点多态性在正常健康女性及URSA患者中基因分布频率差异有统计学意义。基于不同种族、地域、样本选择的偏差，研究方法的差异及RSA的影响因素复杂多样，叶酸代谢相关基因与URSA的相关性研究结果亦有不同。由于URSA病因复杂，不能一一排除环境因素、生活习惯因素及部分流产胎儿存在隐匿的基因缺陷及男方因素导致的流产 [31] 。三个主要位点的基因突变所导致的叶酸代谢障碍风险与URSA的相关性有待进一步商榷，仍需大范围、大样本及严格设定纳排标准后进一步确定，并需探讨环境和其他遗传因素调控特定SNP在特定疾病的病因中所起的作用。
致谢
本篇论著从选题、审题、再到研究具体问题、严格把关，倾注了自己的辛苦与汗水，同时感谢我们生殖医学科的所有同事，在工作上给予帮助和支持，使我有了充足的时间投入我的论文创写中，在此我表示对他们的衷心感谢。同时我还要感谢在我论文期间给我极大帮助、关心和支持的还有在我背后默默支持我的朋友和家人们，你们辛苦啦！
最后，向审阅本论著的专家、教授及卢编辑的辛勤付出表示衷心的感谢。感谢您们在百忙之中的辛勤审阅和指导。
参考文献