1. 引言
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)广泛分布于我国长江、珠江、黑龙江流域,是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一 [1] 。其具有营养丰富、食物链短、成活率高、养殖成本低,兼具低碳、水生生物资源养护、修复水域生态环境等优良特性;且对国内大宗水产品的稳定有效供给、食品安全及大食物观发展理念的贯彻,人们膳食结构改善方面起着至关重要的作用。据统计,2021年全国鲢养殖产量达383.66万吨,居我国淡水鱼类养殖产量的第二位,仅次于草鱼(575.51万吨) [2] ,可见鲢养殖在促进渔民增收、渔业增效及产业高质量发展方面成效显著。长丰鲢(Changfeng silver carp)为中国水产科学研究院长江水产研究所选育的我国“四大家鱼”的第一个水产新品种;与鲢相比,具有生长快、体型好、出肉率高、耐低氧、遗传稳定等优良性状 [3] ,自2010年通过全国水产原种和良种审定委员会审定以来,已推广至全国27个省市、自治区可控的淡水水域进行增、养殖,产生显著的经济、社会与生态效益。此外,长丰鲢性情较鲢稍显温和,但受刺激亦易跳跃,在运输过程中往往造成鲢不同程度的损伤影响其成活率。为了减少鱼的应激反应,提高鲢运输途中的成活率,运输前对其进行麻醉是较好的策略。
鱼用麻醉剂有很多,包括MS-222 (间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)、丁香酚、CO2、喹哪啶、美托味酯等,其中MS-222应用较为普遍。MS-222 (分子式C10H15NO5S)其为白色结晶或粉末,易溶于水,水溶液透明无色,呈微酸性、耐高温。国际商品名称为Fingudi、Matacaine、Tricaine,麻醉时具有浓度低,诱导鱼体入麻时间快且复苏时间短,无毒副作用等优点,是当前世界各国广泛应用于水生动物中安全、有效的麻醉药物。在美国,经美国食品和药物管理局(FDA)认可,MS-222为唯一可用于食用鱼的麻醉剂 [4] ,已经广泛用于鱼类的活体运输、标志放流。MS-222的大量使用可能导致其在水产品中产生残留,给水产品的食用安全性带来潜在的风险。为了保证水产品的食用安全性,国际上对MS-222在水产品中的使用进行了严格规定。如美国FDA规定经MS-222麻醉的食用鱼必须经21 d休药期才可在市场上销售,加拿大规定的休药期为5 d [5] [6] 。有关MS-222的检测方法主要有比色法 [7] 、气相色谱法、液相色谱法 [8] 、液相色谱串联质谱法、高效液相色谱–串联质谱法等 [9] 。国内,目前利用MS-222对水生动物进行麻醉的研究及生理生化影响已有相关报道,如半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、中华鲟(Acipenser sinensis)、施氏鲟(Acipenser schrenckii)、美洲鲥(Alosa sapidissima)、刀鲚(Coilia nasus Schlegel)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、四川华吸鳅(Sinogastromyzon szechuanensis)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、翘嘴鲌(Culter alburnus)、鲢、鳜(Siniperca chuatsi)、花鲈(Lateolabrax maculatus)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、珍珠龙胆石斑鱼(E. fuscoguttatus (♀) x E. lanceolatus (♂))、长蛸(Octopus minor)等 [10] - [26] 。而鲜有研究鲢在MS-222麻醉下其效果及组织内酶活性的变化。本研究以鲢新品种为研究对象,通过比较MS-222在不同麻醉浓度、不同施麻时间条件下对鲢麻醉效果与组织内酶活指标的影响。参考杜浩等的研究方法 [12] ,将50~130 mg/L浓度定义为高浓度,将10~30 mg/L浓度定义为低浓度,对鲢在高浓度下的生理指标的变化和在低浓度下麻醉剂溶液对肝脏、脾脏、鳃的抗氧化酶活性进行研究,探究高浓度条件下急性麻醉,低浓度条件下长效麻醉的最合适浓度,为在鲢和长丰鲢的运输中得到应用提供参考。
2. 试验材料与方法
2.1. 试验材料
2.1.1. 试验鱼
试验鲢采自中国水产科学研究院长江水产研究所梁子湖试验场,其规格体重为(105 ± 5.0) g,体长为(18 ± 2.0) cm,暂养试验场养鱼车间塑料桶(容积为200 L)中1周,每个桶放20尾,气泵持续通气以维持氧浓度,水温为(17.8 ± 0.5)℃,溶氧量保持在(7.77 ± 0.30) mg/L。在试验中,选择健康、无伤、规格整齐的鲢进行试验。试验用水来自曝气后的自来水。
2.1.2. 试验试剂
本试验使用的试剂MS-222麻醉剂购买自于上海希格玛高技术有限公司,CAT试剂盒,ACP试剂盒,AKP试剂盒购自南京建成生物工程研究所;蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司合成。
2.2. 麻醉方法
试验鱼使用MS-222麻醉时使用一定量的碳酸氢钠调节实验容器水体的pH值,控制在7.0~7.5范围。
2.2.1. 高浓度麻醉方法
试验时,在塑料桶注入30L经曝气的自来水,分别加入1.5、2.1、2.7、3.3、3.9 g的MS-222粉末,充分搅拌使其溶解,配置成浓度为50、70、90、110、130 mg/L的麻醉剂溶剂,并设对照组。每个浓度设置三组重复。每个塑料桶中投放鲢5尾,同时计时观察。
2.2.2. 低浓度麻醉方法
试验时,在塑料桶注入曝气的自来水200 L,并分别在塑料桶中加入2.0、4.0、6.0 g的MS-222粉末,充分搅拌使其溶解,配置成浓度为10、20、30 mg/L的麻醉剂溶剂,同时设空白对照组。每个浓度设置三组重复。每个塑料桶中放入鲢20尾,同时开始计时观察。放鱼后分别在1、3、6、12、24 h时间点每个塑料桶中各取出5尾鲢进行解剖,采集肝、脾、鳃组织后立即放入液氮中保存备用。
2.3. 样品处理方法
取低浓度MS-222麻醉处理1、3、6、12、24 h的组织样品解冻。将其肝脏、脾脏、鳃组织分别称取0.1 g以组织样:生理盐水 = 1 g:10 ml混合。混合后在高速组织研磨仪中60 HZ低温研磨30 s。匀浆后将匀浆液置高速冷冻离心机4℃,2500 r/min,离心10 min。取上清液即为10%的组织匀浆,测定不同MS-222麻醉处理时间的鲢肝脏、脾脏、鳃组织中过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性,所有试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司,参照说明书进行检测。吸光度使用NP80型超微量分光光度计进行测定。得到结果代入公式1、公式2、公式3计算。由于酶活计算时需要各组织的蛋白浓度,所以使用试剂盒对各组织蛋白浓度进行测定并代入公式(见图1)计算。
(公式1)
注释:X1代表对照OD值,X2代表测定OD值,下同。
(公式2)
(公式3)
2.4. 数据处理
使用WPS office和SPSS 22.0软件对数据进行处理及图表、表格的制作。统计值为平均值 ± 标准差,在单因素方差分析的基础上采用多重比较,P < 0.05代表数据之间存在显著差异。
3. 结果
3.1. MS-222麻醉下鲢生理行为观察
3.1.1. 鲢麻醉及复苏阶段行为特征
在麻醉剂MS-222对鲢持续作用条件下,不同浓度麻醉下鲢的行为特征及生理状态往往差别较大。本试验观察,参照杜浩、刘长琳等 [12] [27] 对鱼类麻醉与苏醒的分期,可将鲢的麻醉期间分为五个阶段,其行为特征见表1、苏醒期分为三个阶段,其特征详见表2。并结合本试验,将3 min内进入麻醉阶段A4期,5 min内进入恢复R3期的浓度定义为有效浓度。
3.1.2. 麻醉状态下鲢呼吸频率变化
呼吸频率是鲢生理指标中重要的一部分,能够较为直观的反应其麻醉程度。鲢在MS-222药物不同浓度下的呼吸频率如图2所示。在MS-222浓度为50 mg/L的溶液中,鲢的呼吸频率出现小幅度上升后平稳下降。浓度分别为70、90、110、130 mg/L的溶液中,鲢的呼吸频率呈明显下降趋势且未出现小幅度上升,与对照组相比具有显著差异,期间伴随着强烈的应激反应,如迅猛游动,撞击桶壁等。在MS-222浓度为110 mg/L、130 mg/L的溶液中,呼吸频率分别与对照组、50 mg/L、70 mg/L浓度组相比差异显著。由此证明,随着MS-222麻醉剂浓度的不断增加,鲢的呼吸频率下降速度不断增加。这与郭丰红等研究MS-222对鳜的麻醉效果的研究结果一致 [20] 。
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Table 1. Behavior pattern of silver carp anesthetized during anesthetic stages
表1. 鲢麻醉各阶段的行为状况
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Table 2. Stages of recovery and behavioral characteristics of silver carp
表2. 鲢复苏阶段分期及各阶段行为特征
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Figure 2. Changes of respiratory rate of silver carp under different concentrations of MS-222
图2. MS-222不同浓度下鲢呼吸频率的变化
3.1.3. 不同浓度下鲢进入不同麻醉阶段及复苏阶段的诱导时间
在Ms-222不同浓度溶液下将鲢放入麻醉液中,当鲢进入深度麻醉后再将鱼从麻醉溶液中捞出,放入清水中供氧复苏。观察并记录。具体诱导与复苏时间分别见表3、表4。结果表明,在MS-222浓度为50 mg/L和浓度为70 mg/L的溶液中,鲢进入深度麻醉期的时间较长,平均分别为13 min、8 min,但二者之间差异不显著。在MS-222浓度为90 mg/L的溶液中,鲢进入深度麻醉期的时间平均为6 min,与浓度为50 mg/L麻醉时间差异显著。而在浓度为110 mg/L和130 mg/L的溶液中,鲢能迅速进入深度麻醉期(3.52 min, 2.85 min),与浓度分别为50 mg/L、70 mg/L、90 mg/L相比,差异显著。进入深度麻醉后,对鲢进行复苏操作,结果表明:鲢的复苏时间与MS-222麻醉剂浓度密切相关。在MS-222浓度为50 mg/L和浓度为70 mg/L的溶液中,鲢进入深度麻醉期后仍然保持轻微呼吸,并在3 min左右身体恢复平衡,缓慢游动;在浓度分别为90 mg/L、110 mg/L和130 mg/L的溶液中,鲢能表现出明显的阶段性恢复过程,且差异显著。
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Table 3. Induction time of silver carp in different anesthesia stages under different concentrations of MS-222
表3. MS-222不同浓度下鲢进入不同麻醉阶段的诱导时间
注:不同字母表示数值之间存在显著差异(P < 0.05);“—”表示该阶段表现不明显或急促,未观察到该阶段。
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Table 4. Induction time of silver carp entering different recovery stages at different concentrations
表4. 不同浓度下鲢进入不同复苏阶段的诱导时间
3.2. 麻醉剂MS-222长效麻醉下鲢生化指标变化
鲢在MS-222浓度分别为10、20、30 mg/L溶液中,分别在麻醉为1、3、6、12、24 h时,对其组织的肝、脾、鳃组织进行酶活测定,酶活具体指标分别为CAT活性,ACP活性,AKP活性。
3.2.1. MS-222对鲢组织CAT活性的影响
MS-222对鲢CAT活性影响如表5所示。在同一时间下,鲢肝组织试验组CAT活性相对于对照组均有一定程度的下降,且差异显著。30 mg/L麻醉浓度组酶活总体高于10 mg/L麻醉浓度组但低于对照组,且差异显著;20 mg/L麻醉浓度组酶活虽在3 h后高于10 mg/L浓度组,但差异不显著。在相同浓度下,其他时间点酶活性均低于1 h酶活性,且差异显著,在3 h后基本保持稳定,差异不显著。在同一时间下,10 mg/L麻醉浓度组鲢脾脏组织中酶活相比对照组有明显下降趋势,且差异显著。但在20、30 mg/L麻醉浓度组相比对照组,鲢酶活虽有一定程度下降,但是差异不显著。在相同浓度下,10 mg/L的麻醉浓度组鲢脾组织的CAT活性在3 h出现上升现象后保持稳定,在20 mg/L的麻醉浓度下,鲢活性在下降3 h后保持平稳;30 mg/L的麻醉浓度下,鲢活性则持续下降直至12 h保持平稳,且差异都不显著。在10 mg/L的麻醉浓度下,鲢鳃组织中CAT活性在1 h呈现一定的上升趋势且高于对照,3 h后逐渐下降至对照以下,且差异显著。但在20 mg/、30 mg/L的浓度下,下降趋势明显,在6 h后保持平稳,差异不显著。
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Table 5. Changes of CAT activity in various tissues of silver carp
表5. 鲢各组织CAT活性变化
注:不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05);不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
3.2.2. MS-222对鲢组织ACP活性的影响
MS-222对鲢ACP活性影响如表6所示。在相同时间下,试验组鲢肝组织中ACP活性相比于对照组ACP活性均有上升的趋势,差异显著。在浓度不变条件下,10 mg/L麻醉浓度溶液中,鲢活性虽出现上升,并在后续保持一定平稳,而分别在20、30 mg/L的麻醉浓度下鲢活性上升后在1 h下降,在6 h后保持平稳,但差异均不显著。10 mg/L麻醉浓度的鲢脾脏组织中ACP活性上升到3 h后出现迅速下降现象,随后保持平稳,差异不显著;分别在20 mg/、30 mg/L的麻醉浓度下,鲢脾组织的ACP活性总体出现一定趋势的下降,差异显著;而在同一浓度下,随着时间增加,各浓度下酶活都呈下降趋势,且差异显著。各试验组的鲢鳃组织中ACP活性总体均高于对照组,差异显著。而在同一浓度下,10 mg/L麻醉浓度组鲢ACP活性呈现先上升再下降,随后保持稳定趋势,但差异不显著;分别在20 mg/、30 mg/L的麻醉浓度组,鲢ACP活性下降趋势明显,在6 h后保持平稳,差异亦不显著。
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Table 6. Changes of ACP activity in various tissues of silver carp
表6. 鲢各组织ACP活性变化
注:不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05);不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
3.2.3. MS-222对鲢组织AKP活性的影响
MS-222对鲢ACP活性影响如表7所示。试验组鲢肝组织的ACP活性相对于对照组总体呈现出先上升后下降的趋势,差异显著。在10 mg/L麻醉浓度组,活性在3 h上升后保持一定平稳,差异不显著,而在20、30 mg/L的麻醉浓度下活性则在1 h时上升,在3 h后迅速下降保持稳定,差异亦不显著。在相同时间下,10 mg/L麻醉浓度组鲢脾脏组织CAT活性显著高于对照组以及麻醉浓度分别为20、30 mg/L组。而麻醉浓度为20、30 mg/L组的活性水平相似,差异亦不显著。在10 mg/L麻醉浓度组,鲢脾组织的AKP活性上升到3 h后出迅速下降,在6 h后保持平稳,但差异不显著;在20 mg/L的麻醉浓度组,鲢脾组织的AKP活性在1 h出现略微上升,随后缓慢下降在12 h保持平稳;在30 mg/L的麻醉浓度组,鲢AKP活性则始终呈现一定的波动,但两者差异都不显著。
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Table 7. Changes of AKP activity in various tissues of silver carp
表7.鲢各组织AKP活性变化
注:不同大写字母表示同一浓度不同麻醉时间之间存在显著差异(P < 0.05);不同小写字母表示同一时间不同麻醉浓度之间存在显著差异(P < 0.05)。
4. 讨论
4.1. MS-222对鲢麻醉适宜的浓度范围
本试验鲢规格体质量为105 g左右,在水温17℃左右,持续供氧条件下,MS-222麻醉溶液在110~130 mg/L浓度时,鲢在3 min左右时间内进入深度麻醉期,麻醉后移放至清水水体5 min后可复苏,其对鲢伤害较小。实验表明,MS-222高浓度溶液(110~130 mg/L)适合对鲢鱼种进行短时间操作,如短距离运输、手术、标记、生物学测定等短时间操作。MS-222溶液在20~30 mg/L的浓度下,麻醉剂能够在24 h及以上时间对鲢鱼种起持续作用,适合对其进行较长时间运输作业,如长途鲜活鲢运输等。对商品鲢(规格>1100 g)运输,水温12℃~15℃时,其MS-222适合浓度10~25 mg/L,运输时间70~73 h,成活率可达100% [26] 。综合可得水温12℃~17℃下,MS-222溶液浓度20~25 mg/L可作为鲢鱼种和商品鲢远程运输较合适的浓度。
4.2. MS-222对鲢麻醉后各组织酶活性的影响
CAT广泛分布于生物体中,具有特定的催化作用,可以降解H2O2,并存在于过氧化物酶体中 [22] 。体内某些活性氧,自由基和对身体有毒的物质,需要CAT来清除。因此,MS-222作为一种具有高活性氧的麻醉剂,作用于鲢后使其体内产生大量自由基,引起机体CAT酶的变化。本试验中,鲢各组织CAT酶都出现了一定下降的趋势。MS-222在10 mg/L麻醉浓度下,鲢肝和脾组织的CAT活性下降最为迅速,且差异显著;在20~30 mg/L的麻醉浓度下肝和脾组织的CAT活性下降缓慢,并逐渐保持稳定。在10 mg/L的MS-222麻醉剂浓度下,麻醉剂对鲢的影响较小;在20~30 mg/L的麻醉浓度下,其对鲢始终起作用。
ACP是在酸性条件下催化磷酸单酯水解以及磷酸酶代谢的酶,溶酶体生理功能与ACP也密切相关,构成溶酶体的重要部分,同时在吞噬和包囊反应中,通常伴随着ACP的释放。本试验中,鲢各组织的ACP活性在各个时间点均高于对照组,且20~30mg/L的麻醉浓度下各组织的ACP活性下降较慢,最终低于对照组,说明在短时间内该浓度下鲢体内的ACP始终在组织内参与反应,而随着麻醉剂的不断富集,导致ACP活性最终低于对照组。
作为体内非常重要的调节酶,AKP直接参与磷酸基团的转移,并在免疫系统的调节中起重要作用 [27] 。本试验,鲢肝脏和脾脏部位在1 h时,各个MS-222麻醉浓度组的AKP活性均高于对照组,在3 h后出现下降情况,在麻醉前期,麻醉剂对鲢具有显著的效果。在20~30 mg/L的麻醉浓度下,试验组鲢组织AKP活性低于对照组,可能是浓度过高,导致1 h前已经出现下降现象,而升高现象并未观测到。但是该浓度下AKP酶在1 h后基本保持稳定,可能是该浓度下麻醉剂对鲢始终具有麻醉效果。
5. 小结
本实验对鲢麻醉效果研究表明MS-222溶液在高浓度条件下,110~130 mg/L为有效浓度,麻醉效果最好,适合对鲢进行短时间(0.5~2.0 h)操作。在MS-222浓度为110、130 mg/L的溶液中,呼吸频率分别与0 mg/、50 mg/、70 mg/L浓度组相比差异显著,随着MS-222麻醉剂浓度的不断增加,鲢的呼吸频率下降速度不断增加。在MS-222溶液低浓度条件下,20~30 mg/L浓度鲢麻醉试验组的酶活性高于对照组(未麻醉长丰鲢组),且在一定时间内保持稳定,说明对鲢鱼种在长时间内保持麻醉效果,适宜对鲢进行长途运输。
基金项目
财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系项目(CARS-45-01);中国水产科学研究院基本科研业务费(2020TD33);国家淡水水产种质资源库(FGRC18537)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。