1. 引言
据统计，2020年全球有1930万新增癌症病例和近1000万癌症死亡 [1] 。其中，结直肠癌是一种常见的恶性胃肠道肿瘤，是全球第三大确诊癌症和第二大癌症死亡原因。近年来，结直肠癌患者逐渐年轻化，持续威胁着人民的生命健康 [2] 。目前常见的治疗结直肠癌的方法有手术切除、放疗、化疗和靶向治疗等，其中化疗是临床上治疗结直肠癌的主要方式之一，但随着化疗药物的使用，结直肠癌细胞逐渐产生耐药性，从而导致临床治疗效果不佳，且化疗药物的毒副作用较大 [3] 。因此寻找新型、毒副作用小的抗癌药物迫在眉睫。
枸杞子(Lycii fructus)是茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实，收录在我国第一批“药食两用”的名单中，其既可作为中药材，具有多种药理作用，如抗氧化、抗炎、抗癌等；又可作为食品和保健品开发，如泡水、泡酒等 [4] 。枸杞子的主要化学成分有多糖、类胡萝卜素、多酚等，由于我国种植枸杞子地区的生态环境和气候条件存在差异，故不同地理区域和不同品种的枸杞在大小、颜色、口感风味、功能成分含量以及营养品质等方面均存在显著差异 [5] 。近年来，已有文献报道枸杞多糖的抗癌作用，如马宗琴 [6] 通过磷酸化蛋白组学分析发现枸杞多糖通过增加非小细胞肺癌细胞凋亡蛋白的表达来抑制肿瘤生长；枸杞多糖能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导细胞G0/G1期的阻滞，还通过xCT/GPX4轴诱导乳腺癌细胞铁死亡 [7] 。枸杞多糖可通过抑制肝癌中VEGF的表达，降低血管通透性，从而抑制血管生成 [8] 。枸杞多糖联合CXCL10可以提高荷瘤小鼠免疫器官指数，提高DC细胞数量及其功能，促进Th1型细胞因子分泌及恢复Th1/Th2平衡，从而提高机体抗肿瘤免疫力 [9] ；还可与阿霉素联合应用可以增强抗肿瘤作用，改善肝癌小鼠免疫抑制状态 [10] 等，但对结直肠癌的抗癌作用鲜有报道。因此，本文先采用网络药理学方法分析枸杞子活性成分的抗癌靶点及其潜在的作用机制，并通过体外实验检测了枸杞子提取物的抗结直肠癌的活性，为进一步探讨枸杞子抗结直肠癌的分子机制提供一定的参考价值。
2. 材料与方法
2.1. 数据库
TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，Uniport蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)，TTD数据库(https://db.idrblab.net/ttd)，DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)，GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)，VENNY2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html)，微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)。
2.2. 材料
黑枸杞和红枸杞均购自宁夏杞里香枸杞有限责任公司。结直肠癌细胞HCT116保存于重师生科院实验室。
2.3. 仪器与设备
粉碎机：Media；液晶超声波清洗器：昆山洁力美超声仪器有限公司；101系列电热鼓风干燥箱：常州恩培仪器制造有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；TG-19高速离心机：四川蜀科仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA：上海亚荣生化仪器厂；电子天平：杭州万特衡器有限公司；冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；酶标仪：美国BioTek Instruments公司；细胞培养箱：赛默飞；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。
2.4. 网络药理学分析
2.4.1. 枸杞子活性成分筛选及靶点收集
以“枸杞子”为关键词输入到TCMSP数据库，按照口服生物利用度(OB) ≥ 30%且类药性(DL) ≥ 0.18的标准进行筛选，得到枸杞子的有效成分；再根据其活性成分收集对应的靶点信息，并利用Uniport蛋白数据库将靶点名称转换成对应的基因名称，删除非人源基因，得到枸杞子活性成分对应的基因名称。
2.4.2. 结直肠癌基因筛选
以“colorectal cancer”为关键词分别在TTD数据库、DisGeNET数据库和GeneCard数据库中查找结直肠癌相关靶点，删除重复值得到结直肠癌的作用靶点信息。
2.4.3. 构建蛋白质–蛋白质相互作用网络PPI
利用VENNY2.1对筛选得到的枸杞子和结直肠癌靶点取交集，并绘制Venny图。再利用STRING平台构建交集靶点蛋白质–蛋白质相互作用网络PPI，设置物种为“Homo sapiens”，置信度大于0.9，其余为默认值，生成蛋白互作网络，再将其导入到Cytoscape 3.9.1软件中进行可视化，并进行拓扑分析得到关键靶点。
2.4.4. 富集分析
将获取得到的交集基因导入到Metascape数据库进行基因本体(GO)生物学功能富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析。GO按照生物学过程(BP)、细胞组成(CC)以及分子功能(MF)三个方面来描述靶基因抗肿瘤的生物过程，KEGG则分析靶基因的抗肿瘤通路。最后借助微生信平台分别绘制气泡图和柱状图。
2.4.5. 构建疾病–成分–靶点–通路网络图
运用Cytoscape 3.9.1软件构建“疾病–成分–靶点–通路”网络图，根据内置插件对拓扑参数分析，参数设置主要为度值，介度中心性和连接度中心性，根据分析结果得到核心成分。
2.5. 细胞培养
2.5.1. 细胞复苏
提前配制DMEM完全培养基(含10% FBS、青霉素和链霉素)。将储存在液氮罐中的HCT116细胞迅速放入已经提前加热至37℃的水浴锅中，放入后快速摇动以缩短解冻时间。提前准备10 mL无菌离心管，将解冻后的细胞从冻存管中吸至无菌管中，1000 rpm离心5 min，在超净工作台中取一个60 mm2的细胞培养皿，加入3 mL DMEM完全培养基备用；离心结束后丢弃上清液，加入1 mL DMEM完全培养基重悬细胞，并转移至60 mm2培养皿中，在超净工作台以十字架方式上下左右轻轻摇匀细胞，随后置于5%，饱和湿度，37℃无菌细胞培养箱中培养。
2.5.2. 细胞传代
待HCT116细胞铺满细胞瓶底约为80%即可传代。用移液器将培养皿中的培养液去除干净后，用PBS清洗一次，加入1 mL的胰蛋白酶细胞消化液，轻轻晃动，将培养皿放入细胞培养箱消化1~2 min，用显微镜观察细胞变圆后加入1 mL DMEM培养基终止消化。用移液器反复吹打成单细胞悬液，然后立即转移至提前备好的10 mL无菌离心管中，1000 rpm离心5 min。离心结束后弃上清液，加入1 mL DMEM完全培养基重悬细胞。向100 mm2细胞培养皿中加入8 mL DMEM完全培养基，取重悬好的细胞液的1/3或1/2加入到加入培养液的100 mm2培养皿中，在超净工作台以十字架方式上下左右轻轻摇匀细胞，随后置于5%，饱和湿度，37℃无菌细胞培养箱中培养。
2.5.3. 细胞冻存
收集处于对数生长期状态良好的人结直肠癌细胞HCT116，吸走培养皿中的上清培养液，从培养皿边缘轻轻地加入2 mL PBS缓冲液清洗细胞两次。加入1 mL胰蛋白酶细胞消化液后放回37℃培养箱中消化2 min，然后在光学显微镜下观察，若细胞变圆，加入1 mL DMEM完全培养基终止消化，然后用1 mL移液枪反复吹打培养皿壁上的细胞使其完全脱落，吹打下来的细胞悬液立即转移至10 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。弃上层液体后，向离心管中加入专用细胞冻存液3 mL将细胞重悬，轻轻混匀后将重悬液体转移至已灭菌的细胞冻存管中，每管1 mL。先放置于4℃保存30 min，再于−20℃保存2 h，然后转移至−80℃冰箱中保存24 h后，再将冻存管转入液氮罐中长期保存。
2.6. 枸杞子粗提物提取
取20 g黑枸杞和红枸杞去蒂烘干，去除大部分水分，烘箱温度设置50℃，烘干时间8 h。黑枸杞和红枸杞烘干后利用研磨机研磨成粉，放入瓶内密封备用。将黑枸杞粉末和红枸杞粉末分别倒入两个锥形瓶A、B内，加入70%酸化乙醇(料液比1:25)，摇晃均匀，置于37℃水浴锅内浸泡提取2.5 h。浸泡提取后进行超声波提取，将锥形瓶转移至超声波清洗机中进行提取，提取条件：温度30℃，功率100 W，频率120 Hz，超声时间30 min。取提取液上清液进行离心，转速3500 rpm离心15 min，弃去沉淀，将提取液倒入旋转蒸发仪烧瓶内，温度为45℃、中速旋转，直至提取液不再蒸发出乙醇，视为浓缩完成。将浓缩液倒出，用少许一级水清理瓶壁，并与浓缩液合并。将浓缩液放入−80℃冰箱冷冻30 min，冷冻干燥机预制冷30 min，冷冻干燥时间36 h。干燥完成后，取出粉末，去氧保存。
2.7. MTT法测定细胞活力
取浓度调整至5 × 104个/mL的对数期HCT116细胞，每孔100 uL接种于96孔培养板，培养24 h直至细胞贴壁完全。分别用含有0 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL浓度的黑枸杞粗提物和红枸杞粗提物替换原有培养基，并设置空白对照孔，每个浓度做五个复孔。放入细胞培养箱中，培养条件为37℃、5% CO2、48 h。培养完成后，取出培养板，每孔加入10 uL 5 mg/mL MTT，继续培养4~6 h，吸走上清后每孔加入150 uL DMSO，摇床震荡10 min，在490 nm波长处测吸光度(OD)值，并计算相对细胞活力。存活率计算公式为(加药组OD − 空白OD)/(对照组OD − 空白OD)。
3. 结果
3.1. 网络药理学预测结果
3.1.1. 枸杞子活性成分筛选
在TCMSP数据库中以“枸杞子”为关键词进行检索，基于口服生物利用度OB ≥ 30%且化合物类药性DL ≥ 0.18的标准，筛选到35个活性成分(见表1)。
Table 1. Main active ingredients of Lycii fructus
表1. 枸杞子主要活性成分
3.1.2. 核心靶点筛选
对活性成分进行靶点预测，共得到202个作用靶点，以此构建“枸杞子活性成分–靶点”网络图，包含234个节点，389条边，其中槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等成分作用的靶点较多，分别为148、36和30个。
在TTD数据库中以“colorectal cancer”为关键词得到93个靶点；在DisGeNET数据库中以“colorectal cancer”为关键词，筛选条件为Score ≥ 0.3，得到702个靶点；在GeneCard数据库中以“colorectal cancer”为关键词，筛选条件为Relevance score ≥ 10，得到1533个靶点。对所获得的靶点进行合并去重后得到2073个靶点。
为进一步明确枸杞子和结直肠癌的共同靶点，对获取的枸杞子的202个靶点和结直肠癌的2073个靶点交集，得到121个可能与枸杞子抗结直肠癌作用相关的靶点。运用String数据库构建了121个靶点的PPI网络，将数据导入Cytoscape 3.9.1软件，进行网络分析，包含121个节点，511条边。根据CytoNCA进行拓扑分析，得到10个核心靶点分别为TP53、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、RELA、ESR1、TNF、FOS、MYC、MAPK14，见表2。
3.1.3. GO分析及KEGG通路富集分析结果
利用Metascape数据库对相关靶点进行生物过程、细胞组分和分子功能3个方面的GO分析，根据校正后的P值分别选择排名前10的条目绘制柱状图，如图1。
Table 2. Key target network node parameters
表2. 关键靶点网络节点参数
Figure 1. GO analysis of target points for the treatment of colorectal cancer with Lycii fructus
图1. 枸杞子治疗结直肠癌靶点GO分析
对筛选出的10个核心靶点进行KEGG通路富集分析，筛选出排名靠前的20条通路(P < 0.05) (如图2)。由图可知，主要涉及癌症通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、松弛素信号通路等。
Figure 2. Analysis of KEGG pathway for the treatment of colorectal cancer with Lycii fructus
图2. 枸杞子治疗结直肠癌靶点KEGG通路分析
3.1.4. “疾病–成分–靶点–通路”网络图构建
根据Cytoscape 3.9.1软件构建“疾病–成分–靶点–通路”网络图。如图3所示，35个活性成分可通过121个靶点主要通过20条信号通路中发挥作用，说明枸杞子可能通过多成分、多靶点、多通路抑制结直肠癌的发生和发展。其中度值最大的前5个活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、阿托品和黄豆黄素，见表3。
3.2. 体外实验验证结果
枸杞粗提物对HCT116细胞活力的影响
为了验证网络药理学的筛选和预测结果，我们利用乙醇对枸杞子的活性成分进行提取，并采用冷冻真空的方法进行干燥，获取枸杞子的粗提物。采用MTT法测定不同浓度黑枸杞和红枸杞粗提物对结直肠癌细胞HCT116活性的影响。如图4所示，两种枸杞提取物对HCT116细胞活力均有一定抑制作用，且黑枸杞提取物的抑癌效果优于红枸杞提取物。
Table 3. Network node parameters of main active ingredients in Lycii fructus
表3. 枸杞子主要活性成分网络节点参数
Figure 3. Network diagram of “disease-component-target-pathway”
图3. “疾病–成分–靶点–通路”网络图
(a) (b)
Figure 4. Effect of Lycii fructus crude extract on the viability of HCT116 cells
图4. 枸杞粗提物对HCT116细胞活力的影响
4. 讨论
网络药理学可以在分子水平方面分析化合物多靶点、多通路调控疾病的可能机制，提供药物–靶点–疾病之间的相互作用关系，为重要的药理研究提供了更多的方向 [11] 。本研究检索出枸杞子共188个化学成分，根据筛选得到35个主要活性成分，包括槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等成分。其中，槲皮素是一种黄酮类化合物，已报道在包括结直肠癌等多种癌症中发挥作用 [11] ；β-谷甾醇是一种含量丰富的植物甾醇，具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤作用等 [12] ；豆甾醇是广泛存在于大豆、谷物等食物的不饱和甾醇，对皮肤癌、肝癌、胃癌等都有一定的抑制作用 [13] 。
通过网络药理预测，35个化合物可以通过121个潜在靶点与结直肠癌相关。根据拓扑分析可以得到TP53、HSP90AA1、AKT1、MAPK1、RELA等是枸杞子治疗结直肠癌关键的潜在靶点。如：TP53主要通过抑制损伤细胞的分化，调节细胞周期，诱导细胞程序性死亡，激活衰老，与其他抑癌基因相互作用来发挥作用 [14] ；HSP90AA1是HSP90家族的应激诱导成员，在肿瘤发病过程中调节一系列原癌基因表达，并能促进肿瘤的进展、侵袭和化疗耐药性 [15] [16] ；AKT1在组织中分布广泛，也是PI3K/Akt信号转导通路下游的主要作用靶点，其通过磷酸化激活抑制下游的多种作用底物，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖和分化等 [17] ；MAPK1即ERK2，是ERK信号通路的关键节点，其通过磷酸化激活后由细胞质转位到细胞核，从而来激活下游通路蛋白磷酸化引起细胞多种生物学功能的变化，如细胞增殖凋亡、氧化应激等 [18] ；RELA又名转录因子p65，是NF-κB转录因子的一个重要组成部分，是各种炎症反应、应激反应和细胞凋亡等重要生理和病理过程的关键分子 [19] 。
GO分析表明，枸杞子主要活性成分靶点主要通过与DNA结合转录因子、蛋白特异性结构域、转录辅助调节因子、激酶等结合来发挥作用。从KEGG富集分析的通路来看，枸杞子主要涉及癌症途径、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌症、化学致癌–受体激活、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、HIF-1信号通路、铂类药物耐药性等。
为了验证网络药理学的预测结果，我们通过体外细胞实验，初步明确了枸杞粗提物抗结肠癌的活性。MTT结果显示，黑枸杞和红枸杞的粗提物都具有一定的抗癌活性，其中，黑枸杞粗提物比红枸杞粗提物抗癌效果更好，推测这与黑枸杞含有更多的抗氧化物质如花青素有关。在肿瘤细胞内，一定水平的活性氧水平有利于肿瘤细胞的生长。推测：黑枸杞中的花青素会清除胞内的活性氧，从而抑制肿瘤细胞的生长。当然这个推测还有待进一步的验证。
在进行网络药理学分析时，由于枸杞子的化学成分较多，没有对所有成分进行全面分析；此外，在体外实验研究中，仅分析了枸杞子粗提物对体外结直肠癌细胞活性的影响，还有待进一步优化提纯，进一步明确抗癌成分；最后，对于枸杞子抗癌的机制还有待进一步深入研究，尤其是探究其抗癌功效与抗氧化的关联。
综上所述，本研究基于网络药理学证明了枸杞子可通过多靶点、多通路联合调控结直肠癌，并通过体外实验验证了枸杞子粗提物的抗癌活性，为枸杞子抗结直肠癌的进一步机制研究提供了一定的理论参考。
NOTES
*通讯作者。