1. 引言
急性脑梗死(acute cerebral infarction, ACI)是一种局部脑血液循环障碍引起的神经系统急性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点 [1] 。据统计，在我国，脑梗死是导致死亡的首要原因，每年有超过150万的新增病例 [2] 。ACI发病急，短时间内出现不可逆的脑组织发生缺氧、缺血等症状，进而导致脑功能障碍 [3] 。目前，针对ACI的治疗，重点在于疏通堵塞血管，保证血流再畅通 [4] 。溶栓是临床治疗缺血性卒中最有效的方法，具有促进血管再通和脑灌注的作用 [5] 。但溶栓之后，ACI患者仍面临着复发及死亡风险。因此，寻找新的治疗靶点对缺血性卒中的治疗具有重要意义。
微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的单链非编码内源小分子RNA [6] 。越来越多的实验证明miRNA可能与脑部血管疾病的发生有关并且在这类疾病的进展中发挥重要作用 [7] 。由于差异表达的miRNA具有相对稳定性，因此，差异表达的miRNA在疾病的临床筛查、诊断和预测方面有着重要的意义。例如，ACI患者miR-409-3p的相对表达量上调，并且这种表达水平的升高与美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NHISS)评分呈正相关，说明miR-409-3p可能是ACI患者的潜在生物标志物 [8] 。在ACI患者的血清中发现，miR-138-5p水平降低，并且其对ACI患者的诊断和预后都有一定的诊断价值 [9] 。在ACI患者的血清样本中，miR-497的相对表达量显著升高，这一变化趋势与患者的预后情况密切相关，说明血清中的miR-497表达水平可能成为ACI患者诊断和预后的生物标志物 [10] 。这些之前的研究表明差异表达的miRNA具有成为ACI临床标志物的可能性。
MiR-1298在小鼠心肌缺血再灌注模型中表达水平显著降低，说明，miR-1298可能与心肌梗死的发病机制有关 [11] 。但是，miR-1298在ACI患者中的表达水平和诊断价值仍不清楚。因此，本文研究了miR-1298在ACI患者中的表达水平，研究了其对ACI的诊断价值。此外，我们根据患者的预后情况将患者分为预后良好组和预后不良组，分析了miR-1298在这两组患者中的表达水平并评估了其对预后的预测价值。进一步地，miR-1298的靶基因也被证明。
2. 对象与方法
2.1. 研究对象
作为一项回顾性研究，本文选取125位2020年5月至2022年9月在山东省诸城市人民医院首次发生ACI的患者。经过CT或磁共振成像检查，所有患者均确诊为ACI。ACI的诊断标准为《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》 [12] 。纳入标准如下：首次确诊，既往无脑梗史；有完善的临床资料；在本院接受了规范化治疗。排除标准如下：有严重的肝肾疾病、精神疾病、系统性炎症；恶性肿瘤患者；出血性中风患者；发作期超过24小时。此外，选取93位在本院门诊进行健康体检的年龄、性别相匹配的健康人作为对照组。对照组的排除标准如下：有既往脑梗史，出血性中风史；恶性肿瘤患者；阿尔兹海默症患者。收集患者和对照人群空腹血液样本。本研究符合《赫尔辛基宣言》，获得医院伦理委员会批准。在入选前，所有纳入者均签署知情同意书。
2.2. 临床资料
统计所有志愿者的人口统计学资料，包括年龄和性别。测定生化指标同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)。记录患者的美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS)评分，并根据如下标准对ACI患者进行分组：轻度患者NIHSS小于4，中度患者NIHSS为4~15，重度患者NIHSS大于15。根据MRI成像结果评估患者的梗死面积，小梗死面积小于5 cm3，中等梗死面积为大于等于5 cm3小于10 cm3，大梗死面积大于等于10 cm3。记录所有纳入者的合并症，包括糖尿病、高血压和高血脂。两组纳入者的性别比例、年龄和合并症无显著性差异(P > 0.05，表1)。ACI患者的同型半胱氨酸水平显著高于对照组受试者(P < 0.001，表1)。125位ACI患者中，小梗死面积有63人，中梗死面积组有53人，大梗死面积组有9人(表1)。根据NIHSS评分分组，轻度组有25人，重度组有89人，重度组有11人。
Table 1. Comparison of general information of participants in the two groups
表1. 两组参与者一般资料对比
注：NIHSS，美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale)。
2.3. ACI患者的预后情况评估
在90天后，使用改良Rankin量表(modified Rankin Scale, mRS)对患者进行评价。根据评价结果进行分组：评分为0~2分的患者被划为预后良好组，评分为3~6分的患者被划分到预后不良组 [13] 。
2.4. RNA提取及miR-1298相对表达量测定
用Trizol LS试剂(赛默飞公司，美国)提取总RNA。采用逆转录试剂盒(Takara，日本)对总RNA进行逆转录。采用SYBR试剂盒进行实时荧光定量PCR。使用TB Green® Fast qPCR Mix (Takara，日本)检测miR-1298的相对表达水平。用U6 snRNA作为内参基因。引物由生工生物公司(上海，中国)合成，所使用的引物序列如下：miR-1298正向引物为5'-ACACTCCAGCTGGGTTCATTCGGCTGTCCA-3'，反向引物为5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6的正向引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，反向引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
2.5. 双荧光素酶报告
MiR-1298的合成序列由吉玛公司(上海，中国)合成，序列包括miR-1298 control和miR-1298 mimic。根据预测的靶向结合位点，扩增基因序列，并将其克隆到pGL6-CMV-Luc报告基因质粒中(碧云天，上海，中国)得到野生型载体(SETD7-WT)。定点突变靶向序列，按照上述方法构建突变型质粒(SETD7-MUT)。使用LiPofectamine 3000 (赛默飞，美国)将SETD7-WT或SETD7-MUT连同miR-1298 control和miR-1298 mimic共转染到293T细胞中。培养48小时后，用双萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天，上海，中国)进行检测。
2.6. 统计学分析
SPSS 20.0和GraphPad 7.0用来进行数据处理。计数数据用例数和百分比表示，用卡方检验进行分析。计量数据用平均值±标准差表示，用独立样本T检验，单因素方差分析，多因素方差分析进行统计。MiR-1298的预测价值通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线进行评估。双因素Logistic分析方法用来分析所有指标与患者不良预后的相关性。P < 0.05表示差异显著。
3. 结果
3.1. MiR-1298对ACI患者的预测价值
使用qRT-PCR检测健康对照和ACI患者血清中miR-1298的相对表达量。与健康对照相比，ACI患者miR-1298的表达水平明显降低(P < 0.001，图1A)。ACI患者血清miR-1298表达水平的ROC的曲线下面积为0.904，灵敏度为81.6%，特异度为84.9% (图1B)。
3.2. MiR-1298在不同ACI分组中的表达水平
根据NIHSS评分，ACI患者被分为轻度、中度和重度三组。图2A表明，与轻度组相比，miR-1298的表达水平在中度组中明显降低；与中度组相比，miR-1298的表达水平在重度组中水平下降(P < 0.05)。根据MRI影像学结果，患者分为小面积、中等面积和大面积梗死组。其中，小面积梗死组和中等面积梗死组miR-1298的表达水平无显著差异(P > 0.05，图2B)。与中等面积梗死相比，大面积梗死患者的miR-1298表达水平明显降低(P < 0.01，图2B)。
3.3. MiR-1298对ACI患者预后的预测价值
根据mRS的评分，预后良好组有69名患者，预后不良组有56名患者。预后良好组和预后不良组患者的性别分布，年龄、糖尿病人数分布无显著差异(P > 0.05，表2)。与预后良好组相比，预后不良组的同型半胱氨酸水平、NIHSS评分、高血压人数和高血脂人数明显升高(P < 0.05，表2)。不良预后组的脑梗死面积为中等面积和大面积的人数明显增多，小面积的人数明显降低(P < 0.05，表2)。
Figure 1. Expression level and diagnostic value of miR-1298. A: Expression level of miR-1298 was significantly higher in the ACI group; B: Diagnostic value of miR-1298 for ACI. ***P < 0.001
图1. MiR-1298的表达水平及诊断价值。A：MiR-1298在ACI组中的表达水平明显升高；B：MiR-1298对ACI的诊断价值。***P < 0.001
Figure 2. Expression levels of miR-1298 in different ACI subgroups. A: MiR-1298 levels decreased with increasing degree of ACI. B: MiR-1298 expression levels decreased in the large infarct group. **P < 0.01, *P < 0.05
图2. MiR-1298在不同ACI分组中的表达水平。A：随着ACI程度的加重，miR-1298水平降低。B：大面积梗死组miR-1298表达水平降低。**P < 0.01，*P < 0.05
Table 2. Comparison of general information of patients in the good prognosis and poor prognosis groups
表2. 预后良好组和预后不良组患者一般资料对比
注：NIHSS，美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale)。
对预后良好组相比，预后不良组的miR-1298表达水平明显降低(P < 0.001，图3A)。进一步地，绘制ROC曲线以评估miR-1298对ACI患者不良预后的预测能力。ROC曲线结果显示，miR-1298的灵敏度为75.0%，特异度为91.4%，线下面积为0.915。
Figure 3. Predictive value of miR-1298 for poor prognosis of ACI. A: MiR-1298 expression was reduced in the poor prognosis group. B: Predictive value of miR-1298 for poor prognosis of ACI. ***P < 0.001
图3. MiR-1298对ACI不良预后的预测价值。A：MiR-1298在预后不良组表达量降低。B：MiR-1298对ACI不良预后的预测价值。***P < 0.001
3.4. MiR-1298和SETD7的靶向关系
图4A显示了miR-1298和SETD7的靶向结合位点。荧光素酶报告实验显示，在SETD7-WT组中，转染miR-1298 mimic组的荧光强度降低，说明，miR-1298和SETD7具有靶向关系(P < 0.001，图4B)。与对照组相比，SETD7的mRNA表达水平在ACI患者中表达明显升高(P < 0.001，图4C)。
Figure 4. Target genes of miR-1298. A: Target binding sites of miR-1298 and SETD7. B: Results of luciferase reporter assay. C: Increased expression of SETD7 in ACI patients. ***P < 0.001
图4. MiR-1298的靶基因。A：MiR-1298和SETD7的靶向结合位点。B：荧光素酶报告实验结果。C：SETD7在ACI患者中的表达量增加。***P < 0.001
Logistic结果显示，miR-1298、NIHSS评分和梗死面积与ACI的预后密切相关(P < 0.05，表3)，这说明这三个指标可能是ACI患者的不良预后的预测因子。
Table 3. Correlation between each index and prognosis of ACI
表3. 各指标与ACI预后的相关性
4. 讨论
ACI是由脑血供障碍引起的脑部病变，占脑部血管疾病综述的60%~80% [14] 。寻找早期诊断ACI的血液指标，对于明确病因、指导早期临床个体化治疗、预测病情变化具有重要的临床意义和应用价值 [15] 。MiRNA在不同疾病中表达水平发生改变，可响应不同的病理生理状态，在疾病的诊治中具有巨大潜力 [16] [17] 。许多研究揭示了差异表达miRNA在ACI中的异常表达及重要作用。MiR-210和miR-137在ACI患者中表达降低，miR-153在患者中表达升高，这三个差异表达的miRNA与ACI脑梗死1年内的预后有关 [18] 。通过绘制ROC发现，miR-124的灵敏度为71.67%，特异性为90%，这一结果说明，血清miR-124表达水平对ACI的预测具有较高的特异性和敏感性 [19] 。MiR-29b和miR-424在ACI患者的血清中表达水平降低，并且这些异常表达的miRNA与患者的预后有关 [20] 。以上研究结果都表明，miRNA具有作为ACI临床预测的价值。
本研究重点探讨了miR-1298在ACI的临床诊断价值，及其对ACI的进展和预后的预测能力。本研究对对照组和ACI组受试者的临床资料对比发现，ACI组同型半胱氨酸的水平明显高于对照组。同型半胱氨酸作为脑卒中的一个独立危险因素，是心脑血管疾病的危险因素，与脑梗死密切相关 [21] 。我们的结果表明ACI的出现伴随着同型半胱氨酸水平的升高，与之前的研究结果一致。此外，我们的研究发现miR-1298的表达水平在ACI患者中明显下降，说明miR-1298的异常表达可能与ACI的发病机理有关。进一步研究发现，miR-1298对ACI诊断的灵敏度为81.6%，特异度为84.9%，线下面积为0.904，说明miR-1298具有临床诊断ACI的可能性，可以作为ACI患者的生物指标。心肌缺血再灌注同样是一种由血管堵塞导致的疾病，miR-1298参与这一损伤中，说明miR-1298可能在血管栓塞导致的疾病中发挥作用 [22] 。在2022年的一项研究中证实miR-1298在心肌缺血再灌注大鼠模型中表达下降，其高表达减轻了心肌缺血再灌注损伤，说明异常表达的miR-1298可能与这一损伤相关 [11] 。这些结果都表明miR-1298可能与ACI的发生发展相关。
我们的研究也进一步将ACI患者根据NIHSS评分和梗死面积进行分组并比较了miR-1298的表达差异。NIHSS可以反馈ACI的病情并作为分组的依据，同时也具有预后具有预测能力 [23] [24] 。我们根据NIHSS评分将患者分为轻度组、中度组和重度组。研究结果发现，随着ACI病情的加重，MiR-1298表达量逐渐降低，说明miR-1298与ACI的发展有关，并且可能作为ACI的预后诊断标志物。另外，我们的研究结果发现，miR-1298在大面积脑梗死患者的血清中表达水平更低，说明，其表达水平可能与梗死面积存在相关性。mRS是一种常用的急性大面积梗死的预后结果判定指标 [25] [26] 。本研究根据mRS评定的预后情况将ACI患者分为预后良好组和预后不良组。与预后良好组的表达量相比，预后不良组中miR-1298的表达量降低，说明，miR-1298可能与ACI的不良预后有关。ROC的结果也表明，miR-1298具有预测ACI不良预后的能力，具备作为ACI预后因子的可能性。Logistic分析结果也说明miR-1298是ACI预后的独立预测因子。
MiRNA作为一种非编码RNA，常通过调节靶向基因的表达参与疾病的发生与发展。在本研究中，SETD7被认为是miR-1298的靶基因。荧光素酶报告实验显示，miR-1298的高表达能使SETD7-WT组中的荧光强度降低，说明，miR-1298可以靶向SETD7。Qi等证明，在胶质瘤中，miR-1298和SETD7有靶向关系 [27] 。在这篇文章中，我们发现，SETD7在ACI患者中表达水平上调，这一表达趋势与miR-1298表达相反。在脑缺血再灌注损伤中，SETD7表达水平上调，说明SETD7与脑部损伤有关 [28] 。在缺血性脑病中，SETD7作为miR-153-3p的靶基因参与该病的发展 [29] 。这些结果都表明，SETD7可能参与ACI的发病机制，并且受到miR-1298的调节。但是，本项研究存在一些局限之处，例如：研究样本量少和样本来源单一。
5. 总结
总之，本文证明miR-1298在ACI患者中表达降低且可作为ACI的潜在诊断指标。MiR-1298与ACI的严重程度有关，能区分ACI患者的不良预后结果。MiR-1298是ACI不良预后的独立标志物。作为miR-1298的靶基因，SETD7在ACI中表达水平升高。
利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
NOTES
*通讯作者。