1. 引言
随着分子技术的发展与更新,很多抗寒基因被甄别并表达。通过导入其中的全部或者部分抗寒基因(比如CBF基因 [1] ,COR诱导基因 [2] 、抗冻蛋白基因 [3] 、HSP热休克基因 [4] 、WRKY转录因子 [5] 、AP2/EREBP转录因子 [6] 等),提升园艺及园林植物体本身的能量及代谢系统的平衡性,增强细胞呼吸水平以及渗透调节能力,使植物在适度的低温环境下保持正常的生活能力,经济产量和品质不受到影响。目前研究最多的是CBF转录因子,其信号转导在基因的表达中时刻处于活性,当植物遭受来自外界的寒冷应急,CBF基因被诱导激活,体内的激素、能量、免疫及膜系统被激活共同对寒冷程度做出判断 [7] 。随着更多相关基因的发现及先进手段的使用,植物在寒冷环境中耐受的下限温度会更低,抵御寒冷逆境胁迫的能力会提高,进而寒冷伤害造成的损失也会相应地降低。
简单重复序列(Simple Sequence Repeat,简称SSR)是指重复单位长度和碱基组成基本一致,只有少数基因出现微小的差异的一类短串联重复序列。SSR是以PCR技术为核心的DNA分子标记技术,或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence, MS),或短串联重复标记(Short Tandem Repeat, STR)。SSR广泛用于种子纯度鉴定 [8] 、真实性检测 [9] 、新品种或种质资源之间的亲缘关系分析 [10] 。
紫穗槐(Amorpha fruticosa L.)属于蝶形花科(Papilionaceae)紫穗槐属(Amorpha L.)多年生落叶丛生灌木,适应性强,是是城乡绿化、水土保持的特色树种。“金野”紫穗槐(Amorpha fruticosa “Jinye”)是紫穗槐实生苗的栽培变种,其新梢金黄色,基部黄绿色;新叶金黄色,老叶绿色,具有良好的观赏价值 [11] 。关于“金野”紫穗槐的研究多见于栽培、抗旱生理、抗寒生理等方面。目前尚未有报道关于利用CBF基因甄别紫穗槐与“金野”紫穗槐之间的抗寒能力,也少有利用SSR标记来鉴别两者之间的遗传差异性。本研究比较“金野”紫穗槐和紫穗槐之间的遗传差异并利用SSR分子标记技术进行紫穗槐等两个品种抗寒性的鉴定,以期为学院新品种的选育建立快速的室内检测方法,为新、老品种之间的鉴别在分子水平上提供一定的参考。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
紫穗槐及“金野”紫穗槐品种均选自北京农业职业学院彩色苗木繁育中心,“金野”紫穗槐已于2021年申请新品种权。试验所用材料取自两类品种2022年新萌生枝条的新鲜幼嫩叶片。
2.2. 试验仪器与试剂
移液器、恒温水浴锅、离心机(赛默飞世尔)、紫外分光光度计、凝胶成像仪、PCR仪、水平电泳仪。
试验所用试剂中限制性内切酶、DNAMarker和Taq酶均为青岛西弥斯检测技术服务有限公司产品,其余均为国产分析纯试剂。
2.3. 试验方法
2.3.1. DNA提取
参考CTAB法 [12] [13] 提取DNA,略加修改。用于PCR分析的DNA样品。将“金野”紫穗槐和“紫穗槐”分别设置3个重复,1~3样品对应前者,4~6样品对应后者。
(1) 称取250 mg叶片置于研钵中,加液氮研磨至粉状,转入至2 ml的灭菌离心管中。
(2) 加入65℃预热CTAB抽提缓冲液700 μL、70 μL无水乙醇充分振荡混匀,在65℃恒温水浴中保温1 h,每隔10 min颠倒摇荡数次。
(3) 1 h后取出离心管,冷却至室温,在4℃下离心10 min (12000 r/min)。
(4) 取上层清液转移至另一支2 ml无菌离心管,加入等体积的加入氯仿–异戊醇(24:1),颠倒混匀,在室温下离心10 min (12000 r/min)。
(5) 取上层清液至新的2 ml离心管中,加入2倍体积95%冰预冷的无水乙醇,轻轻混匀。在−20℃下放置30 min,出现絮状沉淀。
(6) 将上述絮状沉淀在4℃离心10 min (12000 r/min),去除上清液,即为DNA沉淀。
(7) 向DNA沉淀加70%乙醇并清洗2次,风干,加入100 μL PH8.0TE缓冲液充分溶解DNA沉淀。
(8) 用分光光度计检测DNA浓度及其与蛋白质比值。新提取的DNA用1倍的TE溶液溶解,贮存在−20℃或−70℃冰箱中备用。用前稀释到10~20 ng/ul的浓度,置4℃冰箱保存。
2.3.2. PCR扩增反应
目前抗寒基因CBF2存在很多已知序列,根据其中的序列特点设计1对引物 [14] [15] ,分为正、反向引物,其中正向引物为:5'-GCTCCGATTACGAGTCTCCGGTTTC-3';反向引物为5'-CAGGCGGTGATTACAGTCCGAAGCT-3' [16] 。PCR扩增反应程序采用25 µL的体系,其中包括:10 × TaqBuffer 2.5 µL,dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 µL,TaqDNA聚合酶0.2 µL,上、下游引物(10 µmol/L)各1.0 µL,DNA模板2.0 µL,双蒸水补足至25 µL。PCR反应扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 S,57℃退火30 S,72℃延伸45 S,35个循环;最72℃延伸5 min,16℃保存。
2.3.3. PCR产物检测
采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。主要过程为1%琼脂糖凝胶制备、胶板制备、加样、漂洗、电泳等步骤 [17] ,最后在凝胶成像仪上观察、照相。其中要注意在吸取DNA样品时,用5 µL量与6*loadingbuffer混合均匀,通过1%琼脂糖凝胶点样后电泳,电泳槽电压控制在100~150 V,时间1小时,电泳完毕用1 × TAE溶液染色约20 min后清水漂洗10 min,在凝胶成像系统上观察、拍照。
3. 结果与分析
3.1. 抗寒基因扩增结果
由图1可以看出,对“金野”紫穗槐扩增出4、7、6条谱带(图中1、2、3);对紫穗槐扩增出6、5、4条谱带(图中4、5、6)。扩增的谱带分子量在400~500 bp之间,1对引物共计扩增出32条谱带,平均每个引物扩增16条谱带。“金野”紫穗槐共扩增出17条谱带,紫穗槐共扩增出15条谱带;2个品种扩增出相同谱带的样品数相同。从每条谱带的数量上看,图中2号样品谱带条数最多;其次是3号、4号样品和5号样品;谱带最少的是1号和6号样品。从谱带的亮度上看,2号样品亮度最优;其次是1号、6号和3号;最暗的是4号和5号。通过PCR产物的检测,紫穗槐两个品种都含有耐寒基因,从谱带的数量及表现来看,两个品种存在一定的差异,“金野”紫穗槐在同样低温环境下具有更强的耐寒潜在能力,相对于紫穗槐具有一定的优势。今后可通过抗寒锻炼来提高“金野”紫穗槐对寒冷的适应性,继续对品种的栽培适应性做深入研究。可继续利用PCR扩增技术来分析植物体内的抗寒基因的表达,亦可在寒冷条件下通过抗寒基因导入来检测相关生理指标的变化。
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Figure 1. Results of cold resistance gene amplification in Amorpha fruticosa “Jinye” and Amorpha fruticosa L.
图1. 对“金野”紫穗槐和紫穗槐抗寒基因扩增结果
3.2. SSR标记差异性分析
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Table 1. Information for SSR marking
表1. SSR标记信息
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Fingerprint information of primer labeled sample sites
表2. 引物标记样品位点的指纹信息
以对照样品为参照,观察各样品与对照样品之间的位点数差异。当样本间差异位点数 ≥ 2,判定为“不同”;当样本间差异位点数 = 1,判定为“近似”;当样本间差异位点数 = 0,判定为“极近似或相同”。样品1号与对照差异位点数为0;样品2号与对照差异位点数6;样品3号与对照差异位点数4;样品4号与对照差异位点数3;样品5号与对照差异位点数3;样品6号与对照差异位点数4 (表1,表2)。除1号样品与对照可判定“极近似或相同”,剩下的样品可判定为“不同”。综合指纹数据和位点信息来看,2号样品(“金野”紫穗槐的一次重复)和对照的差异位点数最多,与同品种或紫穗槐(4~6号)样品间的差异也存在;紫穗槐与对照间的点位全部存在差异,而“金野”紫穗槐的1个样品与对照的位点没有差异。从“金野”紫穗槐与紫穗槐的毛细管电泳对比图(图2)也能看出具有相同的遗传特点但也有一定的差异。峰图符合特异峰的特点 [18] ,主峰独立并且突出,周边有部分小峰,峰值清晰可见,高度在221~1396之间,区域分布范围在180~320之间,为精确分析数据,提高检测精度做出了保证。品种与对照之间SSR标记点位的指纹信息差别肉眼可见,同一品种以及不同品种之间既有一定的联系又存在点位差异,通过对9个点位的比较分析,可初步判定两品种“不同”,而两个紫穗槐品种的遗传背景是否相同,是否存在遗传差异性还有待进一步研究。今后可继续利用SSR标记多态性分析、PCR扩增等位基因,结合聚类分析计算遗传相似系数,通过统计软件并结合指纹数据库对比来判定品种间的遗传差异性。
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Figure 2. A16 peak plot of capillary electrophoresis
图2. A16的毛细管电泳峰图
4. 讨论
4.1. CBF在植物抗寒性方面发挥的作用
植物受低温影响,干物质合成量减少、籽粒干瘪、产量相应降低。为了抵御低温,植物自身会发生一些列变化,比如叶片厚度降低、根系体积增加、细胞结构发生改变等形态变化;同时细胞膜结构的稳定性被迫增强,细胞的组成和代谢调节受到干扰,细胞内部蛋白和磷酸等营养物质发生一系列变化,体内大量酶活性增加等 [19] 。而通过栽培技术及生长调节剂的运用、基因的转入与传导等手段使植物在适当低温的环境下生存能力提高,其目的是充分提高植物自身的抗寒能力。
CBF基因可调控下游大量抗寒基因的表达,包括一系列基因组成员,在调节植物抗寒性方面起到了非常重要的作用。植物在受到寒冷刺激后被激活的ICE蛋白可以诱导CBF基因的表达,脯氨酸、可溶性糖等与抗寒性物质的含量大量增加 [20] 。在低温逆境下,CBF基因可以增强了细胞膜的透性,维持了细胞膜的稳定型,提高了SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性,降低了MDA的含量,植物的抗寒性得到显著提高 [21] 。ABA与Ca2+具有冷信号传递功能,可以将信息传递转录因子,后者再进行给抗寒基因CBF的调控。而在抗寒锻炼下,抗冻蛋白可以通过增强渗透调节能力,提高酶的活性、清除氧自由基等方式来提高细胞的耐寒能力 [22] 。植物的抗寒性决定于外部环境和自身因素的两方面。通过抗寒性品种的筛选、施用与抗寒性有关的激素或者Ca2+、利用基因手段导入CBF调控基因或者LpAFP、CaAPX等功能性基因等方法来提高植物的抗寒水平 [23] 。
4.2. 遗传差异性分析
通过ISSR、SSR等分子水平上的遗传多样性的研究,不仅可以识别系谱之间的亲缘关系远近,又可以在同一品种间进行快速鉴定以识别性状的真伪。张曼等 [24] 对35份朝天椒进行了遗传差异性分析,通过SSR多态信息显示的有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度等变量的变化幅度,利用聚类分析观察遗传相似系数大小,来区分不同种质间的亲缘关系。刘旭颖等 [25] 通过ISSR标记技术对9中耐寒杜鹃花 的亲缘关系进行了研究分析,发现它们的遗传背景之间存在一定的差异性,不同类别的多态谱带表现不同。在育种材料选择、鉴别等方面也可以双管齐下,既观察并比较材料之间的基本生长性状(比如:叶片数、茎宽)、产量和品质(比如:淀粉、蛋白质、纤维素)等 [26] ,同时利用现代分子手段分析资源之间的遗传差异性,这样数据更加准确、结果更加可靠。
5. 结论
“金野”紫穗槐和紫穗槐两个品种都具有PCR产物的检测抗寒基因,但从普带上基因的表达量来看两个品种之间稍有不同,前者的抗寒水平更高,相对于后者具有更加耐寒的潜质。通过SSR标记并综合指纹数据和位点信息观察,“金野”紫穗槐和紫穗槐遗传背景相同,差异点位之间存在差异。“金野”紫穗槐在分子水平上的研究仍处于空白,希望通过本研究为“金野”紫穗槐及相关树种的品种选育及逆境生理提供一定的理论基础。
基金项目
北京市科技计划项目“‘金野’紫穗槐性状基因标记的研究”,基金编号:KM202012448003。
NOTES
*第一作者。