1. 引言
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是临床常见的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内居恶性肿瘤的第六位，死亡率排第四位 [1] [2] ，造成了沉重的社会经济负担 [3] 。HCC高死亡率与其容易侵袭和转移密切相关 [4] [5] ，故鉴定具有诊断价值的分子标志物是重要的科学问题，对HCC精准治疗及改善患者预后具有实用价值 [6] 。乙醛脱氢酶1A1 (acetaldehyde dehydrogenase 1A1, ALDH1A1)在视黄醇转化为视黄醛并最终转化为视黄酸的过程中起到关键的催化氧化作用，而视黄酸信号通路在肿瘤干细胞中参与基因表达调控等多个环节。近年来多项研究表明，ALDH1A1的表达越高，肿瘤患者的预后越差，这提示ALDH1A1的表达水平可能与肿瘤的发生、进展、侵袭和转移密切相关。尤其在消化系肿瘤领域，近年对ALDH1A1表达水平与肿瘤病理特征及患者预后的关系进行了广泛而深入地探讨。然而，ALDH1A1在肝癌中的表达及作用目前仍存在较大争议。故本研究通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)、免疫组织化学法(IHC)检测肝癌细胞及肝癌组织中ALDH1A1的表达情况，并探讨ALDH1A1在HCC中的诊断价值。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
收集2016年1月至2021年12月海南医学院第二附属医院经病理检查确诊的HCC患者49例，其中男性43例，女性6例；年龄24~77岁，中位年龄56岁；以49例HCC组织的配对癌旁组织作为对照。本研究通过海南医学院第二附属医院伦理委员会审批。
2.2. 纳入排除标准
2.2.1. 纳入标准
研究对象为经病理组织学确诊为HCC的连续性选择病例；影像学检查排除其他肿瘤肝脏转移；未合并其他重大疾病；病例资料完整；接受手术治疗前未接受过其他抗肿瘤治疗。
2.2.2. 排除标准
合并其他重大疾病者；病例资料不完整；Aipathwell软件读取报告异常或脱落者；术前接收其他抗肿瘤治疗者。
2.3. 方法
2.3.1. 免疫组织化学染色及结果判断
所有组织样本经石蜡包埋，常规切片(厚度4 μm)。ALDH1A1免疫组化试剂盒购自英国Abcam公司，严格按说明书进行操作。结果判定：应用Aipathwell软件经循迹、选色、运算、分析得出分析结果。阳性细胞比率 = 阳性细胞数/细胞总数 [7] 。IRS = SI (阳性强度) × PP (阳性细胞比率)。SI可分为3级，0级无阳性着色，1级淡黄色弱阳性，2级棕黄色中阳性，3级棕褐色强阳性；PP可分为4级，0级为0~5%，1级为6%~25%，2级为26%~50%，3级为51%~75%，4级为>75% [8] 。按IRS评分高低分级：0~6分设为低表达，7~12分为高表达。以上结果由两位病理医师独立阅片并记录。
2.3.2. 实时荧光定量PCR检测
HepG2与LO2细胞株购置于中科院上海细胞所。ALDH1A1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(上游引物：5′-GACAATGCTGTTGAATTTGCAC-3′，下游引物： 5′-AAGGATATACTTCTTAGCCCGC-3′)。逆转录及荧光定量试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。采用美国ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪进行检测，设定反应条件如下：95℃ 3 min；95℃ 5 s；60℃ 10s；72℃ 15 s，40个循环。
2.3.3. 免疫印迹法检测
ALDH1A1、GAPDH一抗购于英国Abcam公司。蛋白裂解、蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。蛋白样品经SDS-PAGE凝胶恒压电泳。湿法电转法恒流260 mA将蛋白带转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶37℃封闭2 h，加入一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜10 min × 3次。加入二抗，37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min × 5次。ECL化学发光显色。Image J软件分析处理图像。
2.4. 统计学分析
采用GraphPad Prism 8软件对实验数据进行统计学分析。率的比较采用χ2检验，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. ALDH1A1在HCC及其癌旁组织中的表达情况
ALDH1A1在HCC组织中的表达主要定位于细胞浆，间质细胞有少量表达，呈不同染色程度的棕黄色颗粒。HCC组织中ALDH1A1的IRS明显高于癌旁组织，HCC组织的ALDH1A1高表达率为63.3% (31/49)，癌旁对照组织的ALDH1A1高表达率为40.8% (20/49)，两组差异有统计学意义(P < 0.05)，见图1。
SI分级：A：0级无阳性着色，B：1级淡黄色弱阳性，C：2级棕黄色中阳性，D：3级棕褐色强阳性；PP分级：E：0级为0~5%，F：1级为6%~25%，G：2级为26%~50%，H：3级为51%~75%，I：4级为>75%
Figure 1. Staining score of ALDH1A1 in HCC and aracancerous control tissues (×200)
图1. ALDH1A1在HCC及癌旁对照组织中的染色评分(×200)
3.2. ALDH1A1在HepG2及LO2细胞株中mRNA的表达情况
ALDH1A1在人肝癌细胞株HepG2中mRNA的表达明显高于人正常肝细胞株LO2，P < 0.05。见图2。
Figure 2. mRNA expression of ALDH1A1 in HepG2 and LO2
图2. ALDH1A1在HepG2及LO2细胞株中mRNA的表达情况
3.3. ALDH1A1在HepG2及LO2细胞株中蛋白的表达情况
ALDH1A1在人肝癌细胞株HepG2中蛋白的表达明显高于人正常肝细胞株LO2，P < 0.0001。见图3。
Figure 3. Protein expression of ALDH1A1 in HepG2 and LO2
图3. ALDH1A1在HepG2及LO2细胞株中蛋白的表达情况
4. 讨论
HCC通常晚期才能确诊，因此死亡率高，5年存活率仅有5%。肝移植是HCC唯一有效的治疗手段，而器官移植的高昂费用及供体的短缺一直是其应用的主要阻碍，因此探索HCC早期诊断新靶点对肝HCC的防治刻不容缓 [9] 。
乙醛脱氢酶类(aldehyde dehydrogenases, ALDHs)是一组胞质酶，在体内参与乙醇、维生素A及环磷酰胺等物质的代谢，可利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为辅酶将醛类氧化成相应的羧酸，发挥重要的生理作用。ALDH1作为ALDHs家族主要成员之一，常见的基因型包括ALDH1A1，ALDH1A2以及ALDH1A3，其中ALDH1A1广泛表达于人体各个器官组织中。
研究发现，ALDH1A1可以通过维持癌症干细胞特性、改变代谢、促进DNA修复等方式诱发癌症，是多种癌症的标记物 [10] 。Liu等发现，ALDH1A1促进乳腺癌进展，可作为乳腺癌生存不良的标志物 [11] 。Cao等发现晚期非小细胞肺癌患者的ALDH1A1表达水平远高于早期肿瘤患者 [12] 。在胃癌中，Li等发现ALDH1A1过表达与肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移数量呈正相关，ALDH1A1可作为患者总生存期与无复发生存期的独立预后因素 [13] 。Xu等在结肠癌研究中发现，ALDH1A1高表达组较低表达组的侵袭转移更为显著。亦有研究表明，结肠癌中ALDH1A1高表达与肿瘤低分化和患者总生存期短相关。此外，在食管癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌等的研究中，ALDH1A1的促瘤作用也被广泛证实。
虽然ALDH1A1被认为是一种致癌因子，但它在某些癌症中也表现出抑制肿瘤的作用。在Adam等人的研究中，ALDH1A1是胶质母细胞瘤预后较好的指标 [14] 。Wang等人的实验中，低级别腺瘤中ALDH1A1的核表达水平明显高于高级别腺瘤、原发性结直肠癌和相应的肝转移 [15] 。
本研究在细胞学及人体组织学层面研究ALDH1A1在肝癌及正常肝脏中的表达。证明人肝癌细胞株HepG2中ALDH1A1 mRNA及蛋白的表达均明显高于人正常肝细胞株LO2 (P < 0.05, P < 0.0001)。HCC组织中ALDH1A1的表达明显高于癌旁组织(P < 0.05)。这提示ALDH1A1的表达可能与HCC的恶性程度相关，因此，临床上可根据ALDH1A1的表达辅助诊断HCC。
综上所述，ALDH1A1在HCC中表达增加，有望成为诊断HCC的潜在分子靶点，但ALDH1A1在HCC中如何发挥致癌作用的分子机制尚需进一步深入研究。
基金项目
海南省卫生健康行业科研项目(19A200173)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。