1. 引言
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根,主要产于浙江、安徽、四川等地,其气微,味苦、酸,性微寒,具有养血调经、柔肝止痛、敛阴止汗和平抑肝阳等功效,是临床常用的中药 [1] 。白芍主要含有单萜及其苷类、三萜及其苷类、黄酮类、鞣质类等化学成分 [2] 。其中,芍药苷为白芍的主要活性成分,具有镇痛 [3] 、抗炎 [4] 、保肝 [5] 、抗抑郁 [6] 、抗肿瘤 [7] 等药理作用,2020版《中国药典》将其作为白芍药材质量控制标准 [8] 。
白芍配方颗粒是以白芍饮片为原料,经提取、浓缩、干燥、制粒等工艺制成,具有一定规格的直接用于临床使用的颗粒 [9] 。中药配方颗粒成分复杂,其质量受很多因素影响,如原药材来源、生产工艺等 [10] 。中药指纹图谱是一种多指标的质量控制模式,可以较为全面地反映所含化学成分的种类和数量,能够全面、系统、直观地反应药品质量好坏,从而更好地评价中药及其制剂的质量。因此,本研究利用UPLC法建立了白芍药材及其配方颗粒的指纹图谱,对其相关性进行评价,为其配方颗粒的质量控制提供借鉴。
2. 仪器与材料
2.1. 仪器
WatersAcquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司);PDA检测器(美国Waters公司);ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm,美国Waters公司);AL204-IC万分之一分析天平(METTLE RTOLEDO仪器有限公司);KQ-100E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2.2. 试剂与试药
试剂:色谱纯甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司),色谱纯磷酸(国药集团化学试剂有限公司),水为哇哈哈纯净水,其余试剂均为分析纯。
试药:没食子酸(批号:110831-200302,中国药品生物制品检定所)、芍药苷(批号:S-010-180416,成都瑞芬思生物科技有限公司)。
2.3. 药材
10批白芍药材经贵州民族大学民族医药学院王祥培教授鉴定,均为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根,20批白芍药材及其配方颗粒均来源于广东一方制药有限公司,见表1。
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Table 1. Sample information and number
表1. 样品信息及编号
3. 实验方法
3.1. 色谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)色谱柱;流速0.1 mL·min−1;检测波长254 nm;柱温30℃;进样量2 μL;流动相0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(C),梯度洗脱:0 min~1 min,5%~10% C,1 min~3 min,10%~16% C,3 min~5 min,16%~27.5% C,5 min~5.5 min,27.5%~32% C,5.5 min~6 min,32%~36.5% C,6 min~10 min,36.5%~50% C,10 min~18 min,50%~53% C。
3.2. 对照品溶液的制备
取没食子酸、芍药苷对照品适量,精密称定,用50%甲醇配制成含没食子酸、芍药苷质量浓度分别为10.2 μg/mL、141 μg/mL的对照品溶液,冷藏备用。
3.3. 供试品溶液的制备
精密称定各批次白芍药材粉末(过四号筛) 0.5 g,置锥形瓶中,加50%甲醇25 mL,称重,超声提取(功率250 W,频率35 kHz) 30 min,放冷,加50%甲醇补重,摇匀,过滤,取续滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过,得白芍药材供试品溶液(S1-S10)。另精密称定各批次白芍配方颗粒(过四号筛) 1.0 g,按照上述方法制备,得白芍配方颗粒供试品溶液(S11-S20)。
3.4. UPLC指纹图谱建立
3.4.1. 精密度试验
取同一批次白芍药材样品,按“3.3.”项下方法制备供试品溶液,按“3.1.”项下色谱方法连续进样6次,并记录各共有峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
3.4.2. 稳定性试验
取同一批次白芍药材样品,按“3.3.”项下方法制备供试品溶液,按3.1.项下色谱方法分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定,并记录各共有峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明样品溶液在24 h内稳定。
3.4.3. 重复性试验
取同一批次白芍药材样品6份,按“3.3.”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“3.1.”项下色谱方法分别进样,并记录各共有峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明该方法重复性良好。
3.4.4. 指纹图谱的建立
分别精密称取20批白芍药材及其配方颗粒粉末(过四号筛),按“3.3.”项下的方法制备供试品溶液,按“3.1.”项下的色谱条件进行进样测定,记录20批样品的UPLC色谱图,分别导入中药指纹图谱相似度评价系统(2004 A),得到白芍药材、白芍配方颗粒、白芍药材及配方颗粒色谱指纹图谱及对照色谱指纹图谱(见图1~图6)。
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Figure 1. UPLC fingerprint of 10 batches of Paeonia lactiflora Pall. and its formula granules
图1. 10批白芍药材UPLC指纹图谱
3:没食子酸;10:芍药苷。
Figure 2. UPLC control spectrum of Paeonia lactiflora Pall.
图2. 白芍药材UPLC对照图谱
![](//html.hanspub.org/file/5-1710420x10_hanspub.png?20230714101952813)
Figure 3. UPLC fingerprint of 10 batches of Paeonia lactiflora Pall. formula granules
图3. 10批白芍配方颗粒UPLC指纹图谱
4:没食子酸;11:芍药苷。
Figure 4. UPLC control spectrum of 10 batches of Paeonia lactiflora Pall. formula granules
图4. 白芍配方颗粒UPLC对照图谱
![](//html.hanspub.org/file/5-1710420x12_hanspub.png?20230714101952813)
Figure 5. UPLC fingerprint of 20 batches of Paeonia lactiflora Pall. and its formula granules
图5. 20批白芍药材及配方颗粒UPLC指纹图谱
3:没食子酸;7:芍药苷。
Figure 6. UPLC control spectrum of 20 batches of Paeonia lactiflora Pall. and its formula granules
图6. 白芍药材与配方颗粒UPLC对照图谱
3.4.5. 共有峰的确定
建立白芍药材及其配方颗粒的指纹图谱,10批白芍药材确定16个共有色谱峰,10批白芍配方颗粒确定18个共有色谱峰,10批白芍药材与10批配方颗粒共确定11个共有峰。在所有样品图谱中,通过与没食子酸、芍药苷对照品图谱比较,在白芍药材及其配方颗粒指纹图谱中指认出了没食子酸、芍药苷色谱峰。芍药苷为白芍中的主要成分之一,且色谱峰的分离较好,峰面积大小适中,在图谱中较稳定且为所有样品共有,因此确定白芍苷为参比峰(S),计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积,见表2、表3。
3.4.6. 相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004版),以生成的对照谱图为参照,各批次供试品指纹图谱与对照谱图进行比较,分别计算其相似度,结果显示10批白芍药材、10批白芍配方颗粒相似度分别为0.967~0.993、0.995~0.999,表明各批样品一致性好,制剂工艺稳定可行。而两者相似度在0.756~0.989范围内,说明两者相关性较好,该方法可用于颗粒质量评价。
4. 讨论
本文建立21批白芍药材及白芍配方颗粒的UPLC指纹图谱,考查其相似度,并对其相关性进行评估,同时指认芍药苷和没食子酸。指纹图谱结果显示,白芍药材加工为白芍配方颗粒后化学成分个数增加,这可能与白芍配方颗粒的制备过程中要经过一系列的浓缩、干燥、制粒过程,化学成分受到影响有关。另外,相似度评价结果显示,20批白芍药材及其配方颗粒指纹图谱相似度存在差异。因此,对中药配方颗粒生产过程中的提取工艺如加水量、提取温度、分离纯化、提取时间和浓缩技术等一系列工艺参数也要进行统一,让中药配方颗粒的生产走向现代化、规范化 [11] 。而中药饮片质量不稳定会直接影响中药配方颗粒的质量和疗效,如土壤环境、气候问题、不同产地、不同年份的中药材中的有效成分含量有着明显差异 [12] ,因此保障原料质量稳定是中药配方颗粒质量得到保障的前提。
本实验建立白芍药材及其配方颗粒的UPLC指纹图谱,克服了单一成分信息量不全的缺点,较为系统的反应白芍药材及其配方颗粒的化学组成。方法学考察中精密度、重复性、稳定性的RSD < 3%,表明该方法的重复性、可行性及准确度良好,可用于白芍配方颗粒的质量控制。
基金项目
贵州省一流课程重点建设项目(项目合同编号:黔教高发[2017]158)。
表2. 20批白芍药材及配方颗粒共有峰的相对保留时间
![](//html.hanspub.org/file/5-1710420x14_hanspub.png?20230714101952813)
表3. 20批白芍药材及配方颗粒共有峰的相对峰面积
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NOTES
*第一作者。
#通讯作者。