摘要: 目的：基于网络药理学及分子对接的方法研究逍遥散治疗斑秃的作用机制。方法：于TCMSP数据库中，根据ADME筛选，得到逍遥散中8味中药柴胡、当归、白芍、薄荷、茯苓、白术、生姜、甘草的有效成分及作用靶点，以Pharm Mapper补充预测相关靶点，从OMIM、Genecards、Drugbank、TTD数据库中获取斑秃相关靶点，得到二者共有靶点，使用Cytoscape3.9.1软件构建药物成分-靶点网络图。基于STRING数据库构建蛋白质相互作用(PPI)网络，利用Cytoscape3.9.1进行可视化分析。利用Metascape数据库对靶点进行富集分析并进行可视化。将得到的关键成分及靶点利用Autodockvina 1.2.3进行分子对接验证。结果：得到逍遥散作用于斑秃的核心成分104个，包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、阿卡西汀、刺芒柄花素、芦荟大黄素、异鼠李素、甘草查尔酮B等；核心靶点36个，包括PTGS2、NOS2、CDK2、TNF、IL6、IL1B、IFNG、CXCL8等；蛋白相互作用共涉及2958个生物学过程，157条通路，分子对接验证提示连接度最高的前8位核心成分与靶点蛋白结合性能良好。结论：逍遥散治疗斑秃的机制可能通过PTGS2、NOS2、CDK2、TNF、IL6、IL1B、IFNG、CXCL8等关键蛋白起效，过程涉及免疫调节。
Abstract:
Objective: To investigate the mechanism of action of Xiaoyao San in the treatment of alopecia areata (AA) based on network pharmacology and molecular docking methods. Methods: The active ingredients and action targets of eight Chinese herbs, namely Chai Hu, Dang Gui, Bai Shao, Bo He, Fu Lin, Bai Zhu, Sheng Jiang and Gan Cao, were obtained from the TCMSP database based on ADME screening, and the relevant targets were predicted by Pharm Mapper supplementation. The AA’s targets were obtained from OMIM, Genecards, Drugbank and TTD databases to obtain the targets common to both, and the drug component-target network map was constructed using Cytoscape 3.9.1 software. Construct a protein interaction (PPI) network based on the STRING database and use Cytoscape 3.9.1 for visualisation and analysis. Enrichment analysis of targets was performed and visualised using the Metascape database. The key components and targets obtained were validated by molecular docking using Autodock vina1.2.3. Results: 104 core components were obtained for the action of prolotherapy in AA, including quercetin, lignan, kaempferol, acacetin, prickly mangosteen, aloe rhodopsin, isorhamnetin and glycyrrhiza chalcone B. 36 core targets were obtained, including PTGS2, NOS2, CDK2, TNF, IL6, IL1B, IFNG, CXCL8; the protein interactions involved a total of 2958 biological processes and 157 pathways were involved in the protein interactions. The molecular docking validation indicated that the top 8 core components with the highest degree of connectivity had good binding performance to the target proteins. Conclusion: The mechanism of Xiaoyao San for AA may work through key proteins such as PTGS2, NOS2, CDK2, TNF, IL6, IL1B, IFNG and CXCL8, and the process involves immune regulation.
1. 引言
斑秃(alopecia areata, AA)是临床常见的一种皮肤科疾病，中医又称“油风”，主要表现为头皮突然发生的边界清楚的圆形或椭圆形斑状脱发，严重者可累及全身的被毛，部分患者可伴随有甲的改变 [1] 。该病严重影响美观，易导致患者出现焦虑、自卑的情绪，甚者影响患者的心理健康。现代医学表明 [2] ，睡眠改变、个人习惯改变、家庭问题和学习问题与AA患者的发病呈现高度相关性，此一系列应激事件在中医上属于情志范畴，多从肝论治，治从疏肝解郁，加上中医认为“发为血之余”，脱发与气血的问题有着密切的关系，逍遥散一方出自《太平惠民和剂局方》，方中药用柴胡、当归、白芍、薄荷、茯苓、白术、生姜、甘草，有疏肝解郁，养血健脾的功效，理论上与AA的病机相合，近些年也有临床医生用逍遥散合桃红四物汤加减治疗AA [3] ，发现疗效优于胱氨酸片 + 维生素B6口服组，但对其治疗AA的作用机制尚不清楚。本文旨在应用网络药理学的方法，从整体角度研究逍遥散中药物的活性成分及作用靶点，并运用分子对接技术对得到的结果进行验证，以期对逍遥散治疗AA的作用机制进行分析研究，为后续进一步研究提供证据。
2. 资料与方法
2.1. 获取逍遥散主要活性成分及相关靶点
通过中医药系统药理学平台 [4] 查找逍遥散方中8味中药的活性成分，按照口服利用度(oralbioavailability, OB) ≥ 30%且类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18的标准对查找到的活性成分进行筛选，记录下这些活性成分的作用靶点，以PharmMapper [5] 网站作为补充，通过成分分子图，对未收录的活性成分的作用靶点进行预测，后将筛选出的靶点信息统一在Uniprot [6] 蛋白质数据库进行genesymbol名称规范化。
2.2. 获取AA相关靶点
以“alopecia areata”为关键词，在OMIM [7] 数据库(http://www.omim.org)和GeneCards [8] 数据库(https://www.Genecards.org)中进行搜索，其中Genecards数据库检索到的结果中，仅取Relevance score值大于第三四分位数3.59925的部分，即与该疾病联系密切程度相对较紧的部分靶点，将两个数据库中检索到的结果进行整合，删去重复值后，得到AA相关靶点。
2.3. “逍遥散–斑秃”PPI网络构建
为明确逍遥散药物活性成分靶点与AA靶点间的相互作用关系，将两者提交至Venny2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，获得逍遥散成分与AA靶点交集的韦恩图，将获取到的共同靶点导入到SRTING11.5数据库(https://cn.string-db.org)，限定物种选择“Homosapiens”，最小互相作用阈值设定为“medium confidence”(>0.4)，隐藏无连线节点，余设置保持默认状态，获得相应PPI网络图。使用Metascape [9] 平台(http://metascape.org/gp/index.html)对该PPI网络进行分析，得到网络的相关蛋白模块module。
2.4. GO基因富集分析和KEGG通路分析
将逍遥散成分与AA的交集靶点录入到Metascape平台，设置限定物种为“H.sapiens”，P < 0.01，进行GO富集分析与KEGG通路分析，保存数据，整理后导入基于R语言搭建的微生信平台(bioinformatics.com.cn)进行可视化分析。
2.5. 药物–活性成分–靶点–通路网络构建
整合获取到的靶点、通路信息，将逍遥散活性成分、共同靶点、主要作用通路导入至Cytoscape3.9.1，构建药物成分–靶点–通路网络，并使用软件内置工具对该网络进行分析，根据连接度(Dgree)、介度(Betweenness)、紧密度(Closeness)等数据，判断核心作用靶点及主要活性成分。
2.6. 分子对接验证
从RCSB PDB、PubChem网站获取逍遥散核心靶点的PDB文件及逍遥散核心活性成分的SDF文件，使用OpenBabel3.1.1将SDF文件输出为mol2格式，利用PyMOL2.5.4、Autodocktool1.5.7软件进行处理后，得到二者的PDBQT格式文件，使用Autodockingvina1.2.3 [10] 进行分子对接验证，将得到的数据使用HITLOP平台进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 逍遥散主要活性成分
根据TCMSP网站的信息，经ADME筛选，共提取到柴胡成分17种、当归成分2种、白芍成分13种、薄荷成分10种、茯苓成分15种、白术成分7种、生姜成分5种、甘草成分92种。通过Cytoscape3.9.1构建逍遥散活性成分–靶点图，见图1，该网络共有501个节点，3251条边，其中蓝色菱形代表靶点，正六边形代表活性成分，图形面积越大，代表该活性成分作用的靶点越多，或该靶点与逍遥散内活性成分的关联越密切。
Figure 1. Xiaoyao San active ingredient-target map
图1. 逍遥散活性成分–靶点图
3.2. 获取AA相关靶点
以“alopecia areata”为关键词，从Genecards数据库获得AA靶点787个，根据经验取Score中位数值1.332205，但由于该中位数提示的关联度仍较低，故取四分之三位数，即3.375998，最终取Score > 3.375998的197个靶点为AA的潜在靶点。OMIM数据库搜索到相关靶点195个，Durgbank数据库搜索到相关靶点101个，TTD数据库未搜索到相关靶点，将所得靶点结果合并后删除重复值，最终得到308个AA的相关靶点。
3.3. 构建“逍遥散-AA靶点”PPI网络
将筛选的逍遥散活性成分靶点与AA疾病靶点取交集，通过Venny2.1.0绘制韦恩图，得到逍遥散成分-AA共同靶点37个，见图2。将该部分共同靶点提交至STRING11.5数据库，得到逍遥散成分-AA靶点PPI网络，隐去无连线靶点后，余36个靶点，见图3，汇总靶点见表1。经过Metascape平台分析后，得到网络内联系紧密的交集子蛋白，见图4，其中可能涉及的通路包括细胞因子–细胞因子受体相互作用、IgA诱导的肠道免疫、疟疾、类固醇激素的生物合成等。
Table 1. Summary of intersection targets
表1. 交集靶点汇总
Figure 2. Xiaoyao San-alopecia areata intersection target
图2. 逍遥散–斑秃交集靶点
Figure 3. Xiaoyao San-alopecia areata PPI network diagram
图3. 逍遥散–斑秃PPI网络图
Figure 4. Tightly linked target protein submodules of Xiaoyao San in treating alopecia areata
图4. 逍遥散治疗斑秃联系紧密的靶点蛋白子模块
3.4. 靶点功能与通路的KEGG与GO富集分析
应用Metascape数据平台对逍遥散治疗AA相关靶点进行KEGG与GO富集分析。其中GO富集分析包括生物学过程(biological process, BP)、细胞组成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)三部分，富集分析结果显示逍遥散治疗AA的相关靶点共涉及2958个生物过程，选取BP、CC、MF各自前10名富集结果，通过基于R语言搭建的微生信平台，得到可视化结果，见图5，其中涉及的BP主要包括炎症反应、脂多糖应答、对细菌及细菌来源分子的响应、对白细胞迁移的调节、对细胞迁移及细胞运动的正向调节等；CC主要涉及膜筏、薄膜筏、质膜外侧等；MF主要涉及细胞因子及其受体活性、信号受体活性、生长因子及其受体活性等。
Figure 5. GO enrichment analysis histogram
图5. GO富集分析柱状图
Figure 6. KEGG enrichment analysis bubble chart
图6. KEGG富集分析气泡图
KEGG通路分析共富集到157条通路，根据矫正后P值升序排名，选择排名前30的通路，利用微生信平台进行可视化分析，根据参与通路的靶点数从大到小排序，见图6，分析得到的作用通路主要包括细胞因子及其受体相互作用、AGE-RAGE、IL-17信号通路等。
3.5. 构建“药物活性成分–作用靶点–通路”网络
基于以上分析所得数据，筛选出KEGG所得到的结果中logP值由小到大排序前20名的通路，整理出参与这些通路的靶点及其关联的药物活性成分。运用Cytoscape3.9.1构建逍遥散成分-AA靶点–作用通路网络，见图7，该图中，外圈橙色结点代表药物活性成分，绿色倒三角代表通路，中心蓝色矩形代表作用靶点。通过Cytoscape软件内置的NetworkAnalyzer对该网络图进行分析，得到逍遥散治疗AA的核心成分及核心作用靶点。
分析可知，在逍遥散相关活性成分中，与AA的治疗相关度最大的为槲皮素，连接度为19，介度为0.06104，紧密度为0.49695，逍遥散中包含有该成分的包括柴胡、甘草。将该网络图中药物根据连接度从大到小依次排序，选择出前8名的活性成分，列表见表2。
PTGS2在网络中的连接度为107，介度为0.55356，紧密度为0.64682，可初步认为PTGS2为逍遥散治疗AA的主要靶点，PTGS2、NOS2、CDK2、TNF、IL6、IL1B、IFNG、CXCL8同样可被认为是过程中的重要靶点，列表见表3。
Figure 7. “Component-target-pathway” diagram of Xiaoyao San in treating alopecia areata
图7. 逍遥散治疗斑秃的“成分–靶点–作用通路”图
Table 2. Core components of Xiaoyao San in treating alopecia areata
表2. 逍遥散治疗斑秃核心成分
Table 3. The main targets of Xiaoyao San in treating alopecia areata
表3. 逍遥散治疗斑秃主要作用靶点
3.6. 分子对接验证
Figure 9. Schematic diagram of molecular docking
图9. 分子对接示意图
将上述筛选后的逍遥散主要活性成分与AA主要靶点进行分子对接，其中受体蛋白选取多节点，分别与配体进行对接，取Vinascore最小，即二者结合活性最强的一个节点的值作为评估依据，整理数据，进行可视化分析，得到热图，见图8。通常认为，Vina score < −5.0 kcal/mol时，二者结合活性好，< −7.0 kcal/mol时，二者结合活性强，如图所示，可知主要活性成分与靶点蛋白之间均展现了良好的结合性能。其中阿卡西汀与NOS2的Vinasocre最小，提示二者结合活性最强，选取结合活性较好的几组配–受体，分子对接示意图见图9，可见此几组配–受体之间均结合良好，可形成多个氢键，进一步验证了其间良好的结合活性。
4. 讨论
据报道，过去30年间，全球新增AA发病人数1068余万人，涨幅超过49.41%，尤以25~39的女性为主 [11] ，此外，AA对患者的心理健康产生负面影响的潜在风险较高，有数据显示，虽同为脱发，但AA比雄激素脱发更易导致患者出现抑郁、焦虑等不良状态，皮肤病生活指数(Dermatology Life Quality Index, DLQI)更高 [12] 。现代医学通常认为AA是一种由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病 [13] ，与神经精神因素、内分泌，及遗传因素相关。通过实验验证报道的主要免疫学过程为毛囊黑素细胞相关蛋白的T细胞表位肽作为自身抗原，使毛囊周围产生淋巴细胞浸润，诱导相关基因表达，与此过程有关的细胞因子包括有Th1细胞因子反应模式相关的IFN-γ、TNF-β等 [14] 。
中医认为AA病位在肾、肝、脾，与气血因素密切相关，主要病机为肝肾不足，气血虚衰 [15] ，据临床报道，斑秃患者皮损区血流量明显低于健康对照组 [16] ，可以从数据角度对该病的中医病机进行佐证。由于肝主藏血，病机指出AA发病与肝肾密切相关，综合可知，肝为AA发病过程中的重要脏器，而肝为情志之本，肝的疏泄功能失常会导致气滞血瘀，气机不行，故可知AA发病与情志应激这一因素相关，现代医学也有一系列研究可对这一观点进行佐证 [17] [18] 。
本文通过网络药理学方法，对逍遥散中与AA治疗相关的活性成分及其作用靶点、通路进行分析整理，构建出逍遥散治疗AA的“成分–靶点–作用通路”网络。所筛选出的逍遥散主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、阿卡西汀、刺芒柄花素、芦荟大黄素、异鼠李素、甘草查尔酮B等。现代研究指出，槲皮素可通过改善Th1细胞平衡，影响机体的免疫应答 [19] ，有实验显示，在C3H/HeJ小鼠模型中，槲皮素对AA表现出治疗及预防作用 [20] 。槲皮素、木犀草素、山奈酚、阿卡西汀、刺芒柄花素、异鼠李素、甘草查尔酮B同属黄酮类化合物，临床研究发现此类化合物可显著抑制NF-κB信号通路，降低血清中的TNF-α、IL-1β等细胞因子 [21] ，而此两种细胞因子在AA患者血清中的水平较正常健康人有较为显著的增高 [22] ，故可以认为，黄酮类化合物可通过该途径起到抑制AA发病的作用。实验发现，连续灌胃100 mg/kg∙d刺芒柄花素8 w后，能促使大鼠阴道上皮产生性周期变化并促进去势后萎缩的子宫质量增加，具有类雌激素作用 [23] ，而已有实验验证，雌激素能对体外培养的人毛乳头细胞以及毛根鞘纤维母细胞的生长能起到促进作用 [24] ，可考虑刺芒柄花素正是通过这一途径，达到治疗AA的目的。
在逍遥散作用于AA的靶点中，根据“成分–通路–靶点”网络中的连接度排序，得到前8名的靶点分别为诱导型环加氧酶(PTGS2)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6 (IL6)、白细胞介素-1β (IL1B)、干扰素γ (IFNG)、白细胞介素-8 (CXCL8)，表明逍遥散可能通过这8个关键蛋白起到治疗AA的作用。PTGS2的主要作用产物前列腺素具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、抑制免疫监视、促进血管生成的生物活性作用 [25] 。IL1B和TNFα可协同作用，影响ICAM1的表达 [26] ，而ICAM1能介导多种免疫反应，与LFA1的结合对T细胞活化有着重要的共刺激作用 [27] ，且在临床研究中被发现其在AA患者血清中出现了异常增高的现象 [28] ，故可以认为降低ICAM1表达水平有助于治疗AA。
在GO和KEGG富集结果中，提示靶点基因涉及细胞因子及其受体相互作用、AGE-RAGE、IL-17信号通路等。其中IL-17信号通路是由Th17细胞分泌的IL-17细胞因子为主导的信号通路，临床研究发现AA患者外周血清Th17水平较正常人明显升高，且活动期AA较非活动期AA患者外周血清中Th17含量有进一步的提升 [29] ，表明此通路可能参与了AA发病机制。
综上可知，逍遥散的有效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素等，可能通过免疫炎症反应、抑制相关因子表达、调节细胞凋亡等作用发挥AA治疗作用，其机制或与细胞因子及其受体相互作用、IL-17信号通路等通路相关。本研究存在的局限性包括：未能充分考虑中药复方成分反应的复杂性，无法排除数据库算法差异对结果带来的影响等。在文中提到的部分相关通路及靶点，目前还缺乏直接的数据作为支持来佐证其与AA发病的关联，未来可进一步完善相关实验，对其加以验证，以进一步明确逍遥散治疗AA的机制。