缩泉益肾方对高糖诱导的HK-2细胞炎症因子影响的研究

Study on the Effect of Suoquan Yishen Formula on HK-2 Cell Inflammatory Factors Induced by High Sugar

摘要: 目的：观察缩泉益肾方对高糖(HG)诱导的HK-2细胞炎症因子的影响。方法：将HK-2细胞分成N组、HG组、5% SQYSF + HG组、10% SQYSF + HG组、20% SQYSF + HG组、Cana + HG组。经过细胞干预24 h后，使用CCK8法检测细胞存活比率，流逝细胞仪检测细胞凋亡比率，ELISA法检测细胞中TNF-α、IL-1β及IL-6炎症因子水平。使用GraphPad Prism 9.5对实验数据进行统计处理。结果：与N组相比，HG组细胞存活率明显降低、细胞凋亡率和炎性因子浓度显著增加(P < 0.05)；且HG组与5% SQYSF + HG组(简称SL组)、10% SQYSF + HG组(简称SM组)、20% SQYSF + HG组(简称SH组)及Cana + HG组(简称Cana组)相比，差异具有统计学意义(P < 0.05)。与HG组比较，Cana组、SL组、SM组、SH组HK-2细胞存活率明显升高(P < 0.05)。对于TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平的影响，HG组与SL组、SM组、SH组及Cana组差异明显(P < 0.05)。结论：缩泉益肾方可降低HG诱导下HK-2细胞炎症因子水平。

Abstract: Objective: To observe the effect of Suoquan Yishen Formula on HK-2 cell inflammatory factors induced by high glucose (HG). Methods: HK-2 cells were divided into N group, HG group, 5% SQYSF + HG group, 10% SQYSF + HG group, 20% SQYSF + HG group and Cana + HG group. After 24 h of cell intervention, cell survival ratio was detected by CCK8 assay, cell apoptosis ratio was detected by elaptometry, and levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 inflammatory factors were detected by ELISA. Statistical processing of experimental data was performed using GraphPad Prism 9.5. Results: Compared with N group, the survival rate of HG group was significantly decreased, the apoptosis rate and inflammatory factor concentration were significantly increased (P < 0.05). The differences between HG group and 5% SQYSF + HG group (SL group), 10% SQYSF + HG group (SM group), 20% SQYSF + HG group (SH group) and Cana + HG group (Cana group) were statistically significant (P < 0.05). Compared with HG group, the survival rate of HK-2 cells in Cana group, SL group, SM group and SH group was significantly increased (P < 0.05). There were significant differences between HG group and SL group, SM group, SH group and Cana group on the levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β (P < 0.05). Conclusion: Suoquan Yishen Formula can reduce the level of HK-2 cell inflammatory factors induced by HG.

1. 引言

糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease, DKD)与全身和局部肾脏炎症相关，参与关键的炎症细胞、分子和炎症途径，如巨噬细胞、核转录因子-κB (NFκB)、janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)途径和炎症细胞因子的表达 [1] [2] 。在肾脏中，血源性细胞以及不同的内在肾细胞(肾小球细胞、内皮细胞、肾小管细胞和系膜细胞)都能够合成炎症细胞因子 [3] 。这些物质的水平随着DKD的进展而增加，而白细胞介素1 (IL-1β)、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等多种细胞因子的不同作用共同参与了DKD的发病机制 [4] [5] 。其中IL-1β通过诱导磷脂酶A2的产生和前列腺素E的释放，引发肾小球血流动力学异常 [6] ；IL-6则通过诱导炎性细胞向肾小管间质渗透，引发细胞外基质动力学异常，从而使肾小球基底膜增厚、肾脏及足细胞肥大、细胞周期阻滞 [7] ；TNF-α通过与其细胞表面受体相互作用，对肾脏细胞发挥影响，它可以引起细胞毒性反应，诱导及分泌炎症因子、导致细胞凋亡、肾小球血流动力学改变、血管内皮通透性增加，诱导氧化应激的发生 [8] 。有研究发现，早期糖尿病肾小管及肾小球细胞中TNF-α mRNA表达水平升高 [9] 。而中医药在治疗DKD中有其独特的优势，研究发现芪归药可通过激活Nrf2通路调控氧化应激从而改善DKD患者症状 [10] 。Kong等人发现芪归药有减少蛋白尿，抑制肾小球系膜细胞增殖，抑制肾脏炎症反应，抵抗氧化应激反应，以及抑制血管重建等作用，起到保护肾脏、治疗DKD的目的 [11] 。缩泉益肾方由乌药–益智仁药对结合海南本地病证特点加味配伍而成，有丰富的临床应用经验，并取得国家发明专利 [12] ，本研究通过观察缩泉益肾方治疗效果对HK-2细胞内炎症因子的影响，探讨此方在治疗DKD中的可能机制及有效性，为中医药治疗DKD提供新的理论与方法。

2. 材料与方法

2.1. 药物与试剂

海口同仁堂药店购入缩泉益肾方：益智仁10 g、乌药10 g、天花粉10 g、赤芍10 g、苍术10 g、茯苓15 g、丹参15 g，生产批号：201002。按照药物剂量比例，按中药煎煮标准。卡格列净，规格100 mg/片，购自海南医学院第一附属医院，生产批号：KFL9A00。MEM培养基购自普诺赛科技有限公司(武汉)。细胞培养板、培养皿和培养瓶购自LABSELECT公司(北京)。HidffTM qPCR SYBR^®Green Master Mix、胎牛血清(FBS)、Annexin V-FITC/PI试剂盒及逆转录试剂盒(Hifair™II 1st)均购自翌圣生物技术有限公司(上海)。CCK8试剂盒(CK04)购自Dojindo Laboratories公司(日本)。生工生物工程有限公司(上海)购入IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒。

2.2. 细胞复苏与传代

复苏HK-2细胞(购自武汉普诺赛生命有限公司，Procell CL-0110)。将细胞移入含3 ml MEM培养基(含10% FBS + 100X 5%青链霉素双抗 + 90% MEM培养液)的无菌离心管中，1300 r离心5 min，丢掉上清。将细胞转移至培养瓶，在湿度饱和、37℃、5% CO₂环境下孵育。观察HK-2细胞形态，细胞密度范围达到70%~80%时，使用胰酶(EDTA)消化细胞并进行传代，选状态最佳的细胞进行下一步实验。

2.3. 动物与含药血清备制

24只SPF级7周龄雄性大鼠，每只重量(180 ± 20)克(购自长沙市天勤生物有限公司，证号为SCXK(湘)2019~0015。饲养于海南医学院药物评价中心，证号：SYXK(琼) 2016-0016。动物饲养条件：空气湿度50 ± 5%、室温(24 ± 2)℃、换风频率15~20次/h、光照明暗交替/12 h，将SD大鼠分为5组：正常组(N组)、高糖组(HG组)、缩泉益肾方低剂量组(SL组)、中剂量组(SM组)、高剂量组(SH组)，卡格列净组(Cana组)，4只每组。参考王鑫国主编的《中药药理学实验教程》(第二版)，按照人与动物表面积折算法，计算大鼠口服标准剂量为7.2 g/kg∙d，制备为0.72 g生药/mL，保存于4℃备用。N组予等量生理盐灌胃每次2 ml，每天两次，共7次，最后一次灌胃1 h后麻醉，从腹主动脉抽血，将其静置2 h，3000 r离心15 min，取上清液，使用滤菌器过滤，无菌EP管分装，56℃水浴灭菌，并于−80℃储存。Cana配制：根据体表面积每只大鼠口服标准剂量0.009 g/kg∙d换算，电子微量秤称取Cana，无水乙醇溶化，无血清MEM培养基稀释，用孔径0.2 μm滤膜抽滤，分装于青霉素小瓶，保存于−20℃。

2.4. 造模、干预方法与分组

参照参考资料 [13] 与课题组预实验对细胞进行造模。取状态较好的细胞，用EDTA消化后，培养于6孔板，24 h后分组造模：N组(90% MEM培养基)、HG组(HG，60 mmol/L Glucose)、SL组(5%SQYSF + HG，SQYSF含药血清5% + 60 mmol/L Glucose )、SM组(10% SQYSF + HG，SQYSF含药血清10% + 60 mmol/L Glucose)、SH组(20% SQYSF + HG，SQYSF含药血清20% + 60 mmol/L Glucose)、Cana组(Cana + HG，Cana含药血清10% + 60 mmol/L Glucose)。24 h后进行后续实验。

2.5. CCK8法检测细胞活力

分组、干预方法及造模参照“2.4”。取健康细胞，EDTA消化后，将细胞密度调整为5 × 10⁶个/mL，并于96孔培养板中培养，加入100 μL细胞悬液，每组设立6个复孔。HG及药物干预24 h后加入10 μL CCK8溶液/孔，培养箱内孵育半小时，最后用酶标仪在450 nm波段上检测OD值。此实验重复3次。

2.6. 流逝细胞术检测细胞凋亡

将密度约1 × 10⁵个/孔的细胞培养于6孔板中，使用HG及药物干预后，EDTA消化并收集细胞，采用双荧光染料Annexin V-FITC / PI进行处理，使用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

2.7. ELISA法检测细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β水平

分组、干预方法及造模参照“2.4”。取生长状态较好的细胞，于6孔板中培养。经24 h造模及上药后，EDTA消化，无菌管采集细胞，离心机3000 r离心20 min，获得细胞上清。在酶标包被板中加入样品稀释液40 μl，再加入待测样品10 μl。每孔加入酶标试剂100 μl。封板后放于37℃环境中温育60 min。每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，此步骤重复5次。每孔加入显色剂A及显色剂B各50 μl，37℃避光显色15 min。每孔加入50 μl终止液，用酶标仪在450 nm波长处检测OD值，并通过标准曲线计算各组细胞中炎症因子含量。此实验重复3次。

2.8. 统计方法

使用Prism 9.5软件分析和处理实验数据，使用均数±标准差(`c ± s)表示计量资料，采用单因素方差分析评估组内差异。当P < 0.05时具备统计学意义。

3. 结果

3.1. HK-2细胞活力

细胞活力HG组最低。与N组相比较，HG组细胞活力下降(P < 0.001)，与HG组比较，SL组、SH组差异没有统计学意义(P > 0.05)，但SM组细胞活力与之相比显著升高(P < 0.001)，且SM组细胞活力高于Cana组。见图1。

与N组相比，^***P < 0.001；与HG组相比较^##P < 0.01，^###P < 0.001。

Figure 1. Cell survival rate of each group

图1. 各组细胞存活率

3.2. HK-2细胞凋亡率

结果所示，N组细胞凋亡率为1.6%，HG组凋亡率为17.1%，SL组凋亡率是8.2%，SM组凋亡率是4.4%，SH组凋亡率是7.9%，Cana组凋亡率是2.0%。与N组比较，HG组细胞凋亡率明显增加(P < 0.0001)；与HG组比较，经药物处理后，SL组、SM组、SH组、Cana组细胞凋亡率明显下降(P < 0.0001)，见图2。

与N组相比，^****P < 0.0001；与HG组相比较^####P < 0.0001。

Figure 2. Apoptosis rate in each group

图2. 各组细胞凋亡率

3.3. 各组细胞炎症指标水平

3.3.1. IL-1β

IL-1β是由巨噬细胞、脂肪细胞等产生及分泌，可通过炎症反应导致胰岛β细胞发生损伤，加重DKD患者病情 [14] 。我们实验发现在HG胁迫下IL-1β浓度升高，与N组相比差异明显(P < 0.01)。与HG组相比，药物干预后IL-1β浓度均显著降低(P < 0.01)。见图3。

与N组相比，^**P < 0.01；与HG组相比较，^##P < 0.01。

Figure 3. IL-1β concentration in each group

图3. 各组细胞IL-1β浓度

3.3.2. IL-6

IL-6是炎症细胞家族的主要成员，由纤维母细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞等产生，与肾损伤的发生与发展密切相关 [15] 。我们实验发现与N组比较，HG组IL-6浓度显著升高(P < 0.0001)。HG组与药物干预组比较差异明显，其中SM组、SH组IL-6水平显著降低(P < 0.0001)，效果与Cana相当。见图4。

与N组相比，^****P < 0.0001；与HG组相比较^##P < 0.01，^####P < 0.0001。

Figure 4. IL-6 concentration in each group

图4. 各组细胞IL-6浓度

3.3.3. TNF-α

TNF-α是体内重要的炎性细胞因子，在糖尿病患者体内糖基化终末产物(AGE)的刺激下，肾脏固有细胞表达并释放TNF-α，引起肾小球炎症、系膜细胞增生、基底膜变厚、小球硬化和间质纤维化 [16] 。我们研究发现，HG干预后，细胞中TNF-α浓度明显升高，与N组相比差异有统计学意义(P < 0.0001)。HG组与药物干预组比较，差异有统计学意义(P < 0.0001)。见图5。

与N组相比，^****P < 0.0001；与HG组相比较，^####P < 0.0001。

Figure 5. Concentration of TNF-α in each group

图5. 各组细胞TNF-α浓度

4. 讨论

炎症机制在DKD的发生发展中起到重要的作用 [17] [18] ，高血糖会激活多种促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的产生，导致炎症细胞向肾脏募集 [19] [20] 。研究证实，糖尿病患者肾小管损伤与HK-2细胞中HG诱导的促炎细胞因子有关 [21] [22] 。因此，用HK-2细胞来探索DKD的潜在机制。通过CCK8法检测细胞存活比率，实验结果示，HG组细胞的存活率最低，经缩泉益肾方干预后细胞存活率明显增加，说明缩泉益肾方可以增加细胞活力，改善HG诱导的细胞损伤。细胞凋亡是诱导肾细胞进行性丢失的机制之一，从而导致肾小球硬化，肾小管萎缩和肾间质纤维化 [23] ，Lv L.等研究发现，熊果苷可以通过上调miR-2a介导JNK和mTOR信号通路，下调p53和裂解半胱天冬酶-3，并上调Bcl-2表达水平，从而减轻HG诱导的HK-2细胞凋亡 [24] 。本次实验通过流式细胞术检测了HG诱导下各组HK-2细胞凋亡率，结果显示HG组细胞凋亡率最高，而SL组、SM组、SH组及Cana组均可减少HG诱导下HK-2细胞凋亡率。

缩泉益肾方是根据海南地区疾病特点由缩泉丸加味而来，它包含益智仁、乌药、天花粉、茯苓、赤芍、苍术和丹参7味药，其中乌药、益智仁为君，药性辛温，同归于肾脾二经，入太阴、少阴两经，两药配伍，共奏温肾固涩，温脾助阳之功。苍术、赤芍、茯苓、丹参四药入肾经。苍术善祛风燥湿，配伍茯苓甘补淡渗，可固精涩肾。丹参–赤芍为临床上常用的活血化瘀药对，能够养血活血，清热滋阴。天花粉可清热泻火，生津止渴。本方以辛、温、通、补之品散结通络，补益正气，顾护脾胃为法，对DKD有较好的疗效 [25] 。研究发现，缩泉益肾方能减轻DKD患者血清中炎症因子表达水平并改善肾功能 [26] 。本实验通过检测各组细胞中IL-1β、IL-6及TNF-α炎症指标水平，结果发现HG组中IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高，而缩泉益肾方干预后炎症表达水平得到明显抑制。

本研究以HK-2细胞为研究对象，通过测定HK-2细胞存活率、凋亡率，以及HG环境下HK-2细胞中炎性因子水平，评价缩泉益肾方在保护HK-2细胞中抗炎的功效。研究结果表明缩泉益肾方可减少炎症反应及细胞凋亡率，同时增加HK-2细胞存活率，为缩泉益肾方在抗炎，改善细胞活力机制方面提供了理论基础。

NOTES

^*通讯作者。