摘要: 目的：通过网络药理学探究芍药甘草汤有效成分、肾绞痛之间的网络关系，探究芍药甘草汤的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)筛选芍药苷草汤有效成分及相应的靶点；从GeneCards、DisGeNET、OMIM、数据库中获取泌尿系结石疾病相关靶点；使用在线软件平台Venny2.1绘制药物、疾病的交集靶点维恩图；通过Metoscape数据库对交集靶点进行基因本体功能(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；通过STRING在线数据库构建PPI网络，同时导入Cytoscape3.9.1获取核心靶点；通过Cytoscape3.9.1绘制活性成分–靶点网络。结果：芍药甘草汤93种活性成分，共作用于228个靶点；疾病靶点549个，疾病和药物交集靶点41个；核心靶点包括血管内皮生长因子A (VEGFA)、前列腺素内过氧化物合酶-2 (PTGS2)、白细胞介素6 (IL6)、白介素-1β (IL1β)、肿瘤坏死因子(TNF)等；GO富集分析在BP上主要为炎症反应、血液循环等的生物学过程，在CC上表现为膜筏、膜筏、膜微区等结构的细胞定位，在MF上表现为细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性等分子功能；KEGG富集分析主要包括AGE-RAGE、缺氧诱导因子1、白细胞介素-17等通路。结论：芍药甘草汤有效成分可能通过炎症相关通路作用，缓解炎性因子相关性疼痛，从而达到治疗肾绞痛的目的。
Abstract:
Objective: To investigate the network relationship between the active ingredients of peony and licorice soup and renal colic through network pharmacology and to investigate the mechanism of action of peony and licorice soup. Methods: The active ingredients and corresponding targets of Paeonia lactiflora glycyrrhiza tang were screened by the Traditional Chinese Medicine Systematic Pharmacology Database Analysis Platform (TCMSP); the targets related to urinary colic disease were obtained from GeneCards, DisGeNET, OMIM, and databases; the Venn diagram of the intersecting targets of drugs, diseases was drawn using the online software platform Venny 2.1; the Venn diagram of the intersecting targets was obtained by Metoscape database to perform gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on the intersecting targets; building PPI networks through STRING online database, while importing Cytoscape 3.9.1 to obtain core targets; mapping active ingredient-target networks through Cytoscape 3.9.1. Results: There were 93 kinds of Peony and licorice decoction active ingredient, acting on 228 targets; There were 549 disease targets and 41 disease and drug intersection targets; core targets include vascu-lar endothelial growth factor A (VEGFA), prostaglandin endoperoxidase-2 (PTGS2), interleukin 6 (IL6), interleukin-1β (IL1β), tumour necrosis factor (TNF), etc. GO enrichment analysis is mainly for biological processes such as inflammatory response and blood circulation on BP, cellular localiza-tion of structures such as membrane rafts, membrane rafts and membrane micro-regions on CC, and molecular functions such as cytokine activity, receptor ligand activity and signal receptor activator activity on MF; KEGG enrichment analysis mainly includes AGE-RAGE, hypoxia-inducible factor 1, interleukin-17, etc. pathways. Conclusion: The active ingredients of Paeonia lactiflora and Glycyrrhiza glabra soup may act through inflammation-related pathways to relieve inflammatory factor-associated pain, thereby achieving the treatment of renal colic.
1. 引言
肾绞痛是由于泌尿系结石引起的急性肾区疼痛，肾绞痛作为泌尿外科常见的急症，通常表现为患者某侧腰腹部疼痛，部分患者疼痛剧烈，严重者会出现疼痛性休克，严重影响患者健康与生活质量 [1] 。张仲景所创芍药甘草汤作为《伤寒论·辨太阳病脉证并治》代表方之一，全方由芍药甘草两药配伍而成 [2] ，现代药理学研究发现 [3] [4] ，芍药甘草汤具有抗炎、止痛、解痉、松弛平滑肌等作用。药理试验 [5] 显示，芍药甘草汤可改善慢性炎性痛大鼠机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期，芍药甘草汤可能通过上调背根神经节Sema3G表达，抑制IL-6、CCL2mRNA相对表达水平，改善慢性炎性痛。还有学者 [6] 发现，芍药甘草汤能改善帕金森小鼠脑内神经递质水平，缓解肌肉强直的作用。现代临床还将芍药甘草汤用于治疗消化系统疾病、心血管系统疾病以及肿瘤癌症等疾病，均取得了较好的临床效果 [7] 。
本文采用网络药理学方法分析芍药甘草汤方药的有效活性成分和作用靶点，初步探讨芍药甘草汤治疗肾绞痛的作用机制。
2. 资料与方法
2.1. 芍药甘草汤活性成分及靶点筛选
利用中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP)，对芍药甘草汤中2味药(芍药、甘草)进行筛选，筛选标准为OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为阈值设置ADME属性，获取药物相关活性成分。活性成分筛选完成后，再利用该平台获取活性成分作用的蛋白质靶点信息，筛选完成后合并、去重，通过Uniprot基因库(https://www.uniprot.org/)将靶标蛋白转换成靶点基因，对收集到的靶点进行统一规范后记录。
2.2. 芍药甘草汤治疗肾绞痛潜在靶点的预测
以“renal colic”“ureteral colic”为关键词分别GeneCards (https://www.genecards.org/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、OMIM (https://omim.org/)数据库中检索相关疾病靶点。通过Venny2.1.0在线平台绘制韦恩图，得到芍药甘草汤药物活性成分靶点与疾病靶点的交集靶点，即潜在的预测靶点，最终预测出41个靶点。
2.3. 芍药甘草汤治疗肾绞痛的关键活性成分及靶点预测
通过Cytoscape3.9.1软件构建“中药–活性成分–疾病靶点”网络图，同时进行拓扑分析得到芍药甘草汤治疗肾绞痛的关键活性成分及靶点。
2.4. 蛋白质–蛋白质相互作用网络(PPI)构建
通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建蛋白质互作网络，将预测的靶点41个导入该数据库，去除游离节点2个后导入Cytoscape3.9.1通过CytoNCA进行拓扑分析，筛选出芍药甘草汤治疗肾绞痛的核心靶点蛋白。
2.5. 基因富集分析
通过Metoscape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，进行基因本体功能(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，P ≤ 0.01，Min Enrichment = 3。
3. 结果
3.1. 芍药甘草汤的活性成分及其作用靶点
在TCMSP中检索得到甘草的主要活性成分为“甘氨酸、7,2,4-三羟基-5-甲氧基-3-芳基香豆素、黄芩素、菜豆素、补骨脂定”等，白芍的主要活性成分为“芍药苷元、11α，12α-环氧-3β，23-二羟基-30-去甲齐墩-20(29)-28，13β-内酯”等。甘草活性成88种，芍药活性成分8种，其中共有成分3种包括异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚，共同作用于228个靶点。
3.2. 交集靶点
分别从GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库中检索得出与肾绞痛相关靶点490、5、65个，合并去重得到549个疾病相关靶点，与芍药甘草汤活性成分作用靶点取交集靶点，最终得出41个交集靶点(见图1)。
Figure 1. Intersection of drug and disease targets
图1. 药物–疾病靶点交集
3.3. 活性成分–靶点网络构建
应用Cytoscape3.9.1软件绘制芍药甘草汤活性成分及作用靶点间的可视化网络(见图2)。发现degree靠前的成分主要为PTGS2、ESR1、CALM等。
Figure 2. Active ingredients-target network diagram (Note: A1~A3 are common components of two traditional Chinese medicines, GC: Glycyrrhiza, BS: Paeony, shape size, light and dark changes in the figure are determined by Degree)
图2. 活性成分–靶点网络图(注：A1~A3两味中药共有成分，GC：甘草，BS：白芍，图中形状大小、明暗变化由Degree值决定)
3.4. PPI网络构建及核心靶点获取
将交集靶点导入STRING数据库，去除游离节点2个，成功构建PPI网络含有39个节点、322条边，将PPI网络导入Cytoscape3.9.1通过插件CytoNCA进行拓扑分析，经过筛选得出核心靶点13个(见图3)。核心靶点为肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1β (IL-1β)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、一氧化氮合酶(NOS3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)、白细胞介素-10 (IL10)、趋化因子配体-2 (CCL2)、C反应蛋白(CRP)、髓过氧化物酶(MPO)、蛋白激酶(AKT1)、前列腺素内过氧化物合酶-2 (PTGS2)、靶向纤溶酶原激活物抑制剂-1 (SERPINE1)、白细胞介-6 (IL6)，说明这些靶点可能是芍药甘草汤治疗肾绞痛的核心靶点。在中药中的主要成分为异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚，说明中药中的这些成分在芍药甘草汤治疗肾绞痛时起主要作用。
Figure 3. PPI network and core target
图3. PPI网络及核心靶点
3.5. GO功能和KEGG通路富集分析
通过Matescape平台对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析后得到，生物学过程(BP)、分子功能(MF)、细胞定位(CC)相关条目，其中BP主要包括炎症反应、血液循环、对脂多糖的反应、细胞迁移的正调节、对细菌来源分子的反应等；涉及的主要MF包括细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、细胞因子受体结合等；涉及的CC包括质膜筏、膜筏、膜微区等(见图4)。KEGG通路富集分析得到106条信号通路，参与的主要通路为糖尿病并发症中的糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGE)-糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)信号通路、缺氧诱导因子1 (hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)信号通路、白细胞介素-17 (IL-17)信号通路等多条信号通路(见图5)。
4. 讨论
现代药理学研究显示，芍药甘草汤有镇痛、抗炎作用 [8] 。本研究发现芍药甘草汤含有多种有效成分，包括异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚等。异鼠李素对不同的致痛因素诱导的疼痛均有较强的镇痛作用，其镇痛机制可能与抑制NF-κB通路，从而减少NO、TNF-α、IL-1及IL-6的表达、合成或释放有关 [9] 。β-谷甾醇能有效地下调肠道中与胆固醇吸收相关的基因表达 [10] 。β-谷甾醇可促进颗粒细胞增殖，抑制凋亡 [11] 。山奈酚是一种天然的可食用黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山奈的根茎，具有抗癌、抗氧化、抗炎等多种功效 [12] 。山奈酚通过直接减少AGE的形成来抑制神经元细胞凋亡，能显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，提高热痛觉和机械痛觉的阈值，对疼痛具有一定的缓解作用 [13] 。从蛋白互作网络的结果来看TNF、IL-1β、VEGFA、NOS3、PPARG等是芍药甘草汤治疗肾绞痛的关键靶点，TNF参与全身炎症反应，IL-1β作为一个重要的炎症介质，能够参与多种细胞活动，包括细胞增殖，分化和凋亡 [14] 。有学者研究 [15] 发现白芍的有效成分芍药苷可以降低炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的水平，抑制胶原诱导性关节炎大鼠的炎症反应。VEGFA可调节血管功能，与血管生成有关。其与VEGFR2受体结合，激活TRPV1和TR-PA1通道，保护感觉神经元上的疼痛信号传递 [16] 。NOS3、PPARG均与氧化应激、炎症相关。
通过联系GO富集分析与KEGG通路富集分析结果发现，芍药甘草汤主要通过调节炎症反应，参与生物调节等功能治疗肾绞痛，并且与AGEs-RAGE、HIF-1、IL-17等多条信号通路相关。AGEs-RAGE是由晚期糖基化终产物(advanced glycosylation endproducts, AGEs)及糖基化终末产物受体(receptor of AGEs, RAGE)组成的信号通路 [17] 。AGEs是在高糖环境下的代谢产物，RAGE是低亲和力模式识别受体家族的重要成员，在先天免疫和适应性免疫中发挥作用 [18] 。HIF-1信号通路通过作用于血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的特异性反应，上调血管内皮生长因子、一氧化二氮、活性氧和血小板衍生生长因子，导致内皮细胞功能障碍、增殖和炎症 [19] 。IL-17是T细胞亚群中Th17细胞分泌的促炎因子，IL-17参与调节炎症级联反应 [20] 。综上所述，芍药甘草汤可能通过异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚等活性成分作用于TNF、IL-1β、VEGFA、NOS3、PPARG等相关靶点，影响AGEs-RAGE、HIF-1、IL-17等多条信号通路，减少致痛介质释放，缓解炎性因子相关性疼痛，从而达到治疗肾绞痛的目的。然而，本研究存在一定的局限性，没有考虑实际药剂量、药物在体内代谢等因素的影响。仍需相关试验，进一步阐明芍药甘草汤治疗肾绞痛的作用机制。