1. 引言
原发性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma)是原发于肝脏的上皮性恶性肿瘤，其中超过90%的肝癌为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) [1] [2] 。我国原发性肝癌发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第2位，疾病负担较重 [3] ，且发现时多为晚期，5年生存率仅有7%~10%，由于部分患者对疾病重视程度不足、缺乏定期检查意识，往往错过了最佳诊疗时机。目前临床常以影像学技术结合生物标志物检测的方法诊断原发性肝癌，现有的血清学标志物大多灵敏度低，特异性各异，临床上常对这些标志物进行纵向评估，或用几种血清学标志物联合诊断肝癌。监测和早期诊断原发性肝癌的生物标志物仍然缺乏 [4] 。
口腔微生物组是由细菌、真菌、病毒、古生菌构成的高度复杂和多样的生态系统，它们悬浮在唾液内或附着于组织表面 [5] 。其中包括700余种细菌、100种真菌以及大量的病毒群落。这些微生物在口腔中定植并处于相对稳定的动态平衡中 [6] ，在消化吸收、合成维生素B及维生素K、防止致病微生物入侵、免疫应答等方面发挥作用 [7] 。随着人类微生物组计划(human microbiome project, HMP)的完成，人们对口腔微生物的认识更加深入，不仅进一步解析了口腔微生物在龋病、牙周病以及口腔癌等口腔疾病发生发展中的作用，还发现口腔微生物与全身系统疾病密切相关，包括类风湿性关节炎、不良妊娠结局和心血管疾病等。而大量口腔微生物通过唾液从口腔进入下游的消化道，因此其与消化系统疾病之间也存在着尤为紧密的联系。
有研究表明胰腺癌与口腔菌群失调、幽门螺杆菌感染、细菌、嗜肝病毒、胰腺内微生物组密切相关。研究显示肠–肝轴的存在影响肝癌的发生 [8] 。Lu等 [9] 首次发现肝癌患者存在舌苔菌群失调。
如今，原发性肝癌治疗策略有限并缺乏公认的筛查工具用于早期诊断。本研究旨在采用16S rRNA扩增子测序技术研究原发性肝癌患者口腔菌群多样性，为原发性肝癌的早期诊断提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 研究对象
本研究选取青岛市市立医院2022年1月至2022年12月临床诊断为原发性肝癌的患者10例作为实验组，另选择同时期的健康体检志愿者10例作为对照组，采集以上人群的唾液标本。所有研究对象对本研究均知情同意，本课题获得了青岛市市立医院伦理委员会的审核同意。其中实验组即肝癌组患者用L组表示，对照组即健康组患者用H组表示。排除标准：伴其它系统重大疾病；有牙科病史和口腔检查发现有活动性牙龈或牙周病；合并慢性腹泻、炎症性肠病；有胃肠道手术史；近4周内使用过抗生素、PPI或益生菌。
2.2. 标本采集
所有研究对象唾液标本收集时间为上午6点至12点，要求研究对象至少在标本收集2小时前不进食、不饮水、不刷牙，清水漱口后手持无菌、无酶冻存管，口含唾液至少1 min，随后使唾液流入试管中，重复多次直到收集的唾液达到2~5 mL，2 h内送至实验室−86℃冰箱保存。
2.3. DNA提取和测序
使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取，使用酶标仪(基因有限公司GeneCompang Limited，synergy HTX)对核酸进行浓度检测，下一步进行扩增检测，扩增后PCR产物使用浓度1.8%的琼脂糖进行电泳检测(北京博美富鑫科技有限公司)对完整性进行检测，使用NanoDrop 2000 (Themo Scientific, USA)测定DNA浓度和纯度。使用引物338F和806R (338F 5’-ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3’/806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行PCR扩增。其操作流程为：(1) 目标区域PCR，(2) Solexa PCR，(3) Nanodrop定量及混样，(4) 过柱纯化，(5) 切胶回收。使用Illumina公司的Novaseq6000平台进行测序，测序类型为PE250。高通量测序文库的构建和基于IlluminaNovaseq6000平台的测序任务由北京百迈客生物科技有限公司(北京，中国)完成。
2.4. 数据处理和分析
首先使用Trimmomatic (version 0.33)对原始数据进行质量过滤，然后使用Cutadapt (version 1.9.1)进行引物序列的识别与去除，其后使用USEARCH (version 10)对双端reads进行拼接并去除嵌合体(UCHIME, version 8.1)，最终得到高质量的序列用于后续分析。
采用QIIME2软件对各样本进行Alpha多样性指数分析，得到各样本物种丰富度和均匀度信息；计算Unifrac距离，进行Beta多样性指数组间差异分析，直观展示不同样本和分组之间的群落结构差异；将高质量序列划分OTU进行物种注释及分类学分析，得到门(Phylum)、属(Genus)分类水平上的物种分布柱状图；基于组间样品LEfSe分析，在不同组间寻找具有统计学差异的Biomarker；基于16S功能基因进行预测分析。使用R软件将分析结果绘制成图。
2.5. 统计学分析
应用SPSS 26.0进行统计学处理，对所有入选的各组计量资料进行正态检验，计量资料表示用均数±标准差或中位数M。符合正态分布且方差齐性两组比较采用t检验，不符合正态分布两组采用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料两两比较采用卡方检验或Fisher精确检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 研究对象基本情况
本研究经过纳入、排除标准筛选后，最终纳入肝癌组(L group)患者10例，健康组(H group)患者10例。两组之间在年龄、性别、体质指数(BMI)指标上无显著差异，在指标血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)及凝血酶原时间(PT)差异显著(表1)。
3.2. 物种注释情况
通过16S rRNA扩增子测序，一共得到1,564,091对Reads，经过双端Reads质控、拼接后共产生1,559,016条Clean Reads，每个样本至少产生44,376条Clean Reads(平均产生77,951条Clean Reads)用于数据分析，每个序列平均有420个碱基对(390~450 bp)。两组一共测得3973个独一无二的序列，代表了口腔中存在的所有菌种，两组样本覆盖率(Coverage)均大于99%。
Table 1. Comparison of basic characteristics in each group
表1. 各组基本特征对比
3.3. OTUs分析
健康组共有OTU 2101个，肝癌组共有OTU 2494个，两组样品共有622个OTU相互重叠，而肝癌组有1872个OTU在健康组中不存在，健康组中有1479个OTU在肝癌组中不存在(图1)。
Figure 1. Venn graphs based OTU numbers
图1. 基于OTU的韦恩图
3.4. Alpha多样性
为了探究肝癌组和健康组中口腔微生物的Alpha多样性，基于秩和检验，计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数，R语言可视化结果显示，肝癌组与健康组相比，α多样性指数均有降低的趋势，但差异无统计学意义 (P > 0.05；图2)。
3.5. Beta多样性
在加权的PCoA图中肝癌组与健康组明显分离，说明使用PCoA分析可以清楚地分出肝癌组和健康组的口腔微生物群。Anosim (analysis of similarities)分析是用于分析多维度数据组间相似性的统计方法，Anosim检验表明肝癌组与健康组之间群落构成有显著差异(R = 0.229，P = 0.001；图3)。
Figure 2. Box plots of Alpha diversity index
图2. α多样性指数组间差异箱线图
Figure 3. Weighted principal coordinate analysis (PCoA) scores plot based on principal components 1 and 2
图3. 基于主成分1和2的Weighted PCoA图
3.6. 各组间Top 10丰度菌群的比较
在门水平上口腔菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、梭杆菌门(Fusobacteriota)组成。其中肝癌组厚壁菌门丰度显著高于健康组(P = 0.005)，变形菌门丰度显著低于健康组(P = 0.041)，拟杆菌门、梭杆菌门丰度则均降低，差异不显著。在属水平上排名前五的是韦荣球菌属(Veillonella)、奈瑟菌属(Neisseria)、链球菌属(Streptococcus)、普氏菌属(Prevotella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)，其中肝癌组链球菌属丰度明显高于健康组(P = 0.023)，梭杆菌属、拟普氏菌属、普氏菌属丰度显著低于健康组(P = 0.019，P = 0.041，P = 0.028；图4)。
3.7. 肝癌组和健康组差异菌属分析
如图5，LEfSe分析的结果显示在门水平上肝癌组厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著高于健康组，Patescibacteria、变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著低于健康组；在纲水平上芽孢杆菌纲(Bacilli)、放线菌纲(Actinobacteria)的丰度显著高于健康组，Gracilibacteria、梭菌纲(Clostridia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的丰度显著低于健康组；在目水平上乳杆菌目(Lactobacillales)的丰度显著高于健康组，Absconditabacteriales_SR1丰度显著低于健康组；在科水平上链球菌科(Streptococcaceae)的丰度显著高于健康组，梭杆菌科(Fusobacteriaceae)的丰度显著低于健康组；在属水平上链球菌属(Streptococcus)的丰度显著高于健康组，而拟普氏菌属(Alloprevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)的丰度显著低于健康组。上述结果与物种组成分析结果一致，可以作为Biomaker为原发性肝癌的早期诊断提供参考。
3.8. 肝癌组和健康组代谢功能预测
根据PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)菌群基因功能预测结果，比较两组口腔菌群的KEGG通路，并筛选出具有显著性组间差异的通路。如图6所示，左侧横向柱状图代表已筛选代谢通路的丰度分别占两组样本中所有代谢通路的百分比，右侧为功能通路丰度在95%CI内的差异比例，右边为P值。在第三级KEGG通路层次，与健康组相比，肝癌组在异生物素的生物降解和代谢途径、传染性疾病相关途径、肿瘤相关途径方面均升高。
Figuer 4. Bar plots of the relative abundances of top 10 flora at the phylum and genus level图4. 门和属水平top 10菌群累积柱状图
Figure 5. LEfSe analysis cladogram of the oral microbiota in healthy group and hepatocellular carcinoma group; histogram of LDA value distribution
图5. 健康组与肝癌组口腔菌群LEfSe分析进化分枝图；LDA值分布柱状图
Figure 6. Variance analysis chart of KEGG metabolic pathway between H and L groups
图6. H组和L组间KEGG代谢途径差异分析图
4. 讨论
口腔和胃肠道在人体内形成了微生物共生的微环境，二者虽是各自独立的，但也互相依存和影响 [10] 。健康人肠道内较少有口腔菌群定植，然而炎症性肠病(IBD)、HIV感染、肝硬化和结肠癌患者肠道微生物组中口腔来源的微生物群有所增加。1998年马歇尔(Marshall)教授提出“肠–肝轴”概念，其认为胃肠道与肝脏之间通过门脉系统，在神经内分泌、免疫应答、肠道屏障功能等方面进行双向的反馈调节。肠道菌群对早期肝癌甚至进展期肝癌具有强大的诊断潜力。有研究通过随机森林模型五重交叉验证确定了30个生物标志物，在75例早期肝癌和105例非肝癌样本之间的曲线下面积达到80.64% [11] 。Xu等 [12] 提出口腔微生物与肠道微生物具有同源性，二者菌群组成相似，并通过消化道、血液、淋巴循环互相影响。据估计，每天约有1 g细菌(约1011个细胞)随着500~1500 mL唾液被吞咽。Zhou等 [13] 由此提出“口–肠–肝轴”理论，用来阐述口腔菌群与肝细胞癌产生关联的可能机制：1. 口腔微生物通过吞咽很容易进入胃肠道，引起微生态失衡，致病菌增加。2. 口腔中的致病菌，通过血液循环作用于肝脏在内的全身各器官。3. 口腔菌群的代谢产物进入到体循环的血液中，使人体处于低度的炎症状态，导致慢性肝炎、肝硬化等疾病的进展。Xu等 [14] 分别对15例肝癌组织和15例癌旁组织进行高通量测序，发现其菌群分类与肠道菌群在门、属分类水平基本一致，提示肝癌的发生、发展可能与菌群有关。
本研究通过16S rRNA扩增子测序技术分析原发性肝癌患者和健康人群口腔菌群微生物多样性，研究结果显示肝癌组较健康组Alpha多样性指数降低，但无显著差异，与现有研究结论不一。Li等 [15] 分析了肝癌进展过程中不同肝病阶段的患者和健康人群唾液菌群的多样性，结果发现肝癌患者口腔菌群多样性较慢性乙型肝炎患者、乙肝肝硬化患者以及健康体检者均显著降低。Lu等 [9] 对35例肝癌患者和25例健康人舌苔菌群进行测序分析，结果发现肝癌患者舌苔菌群多样性显著增高，其中东方菌(Oribacterium)和梭杆菌(Fusobacterium)作为显著差异菌群，是良好的生物标志物。研究结果不一致性可能与物种替代有关，即多样性指数无显著差异，但物种组成不同。同时也受肝癌患者病因、临床分期以及样本和采样方法的影响。Weighted-Unifrac PcoA主坐标分析，其物种组成结构越相似，则样本距离越相近。结果显示肝癌组与健康组呈各自组内聚集，组间呈不同位置及形态分布。说明原发性肝癌患者口腔菌群存在明显失衡。
物种组成分析显示，肝癌组与健康组之间群落构成相同，但相对丰度不同，这意味着肝癌已经改变了患者的口腔菌群。其中与健康组相比肝癌组厚壁菌门丰度显著升高，变形菌门丰度显著降低。厚壁菌门增加可以引起口腔菌群紊乱、黏膜防御功能下降，从而导致口腔致病菌向胃肠道转移。变形菌门门下的细菌均为革兰氏阴性菌，以兼性厌氧菌为主，受环境影响大，与肥胖、糖尿病、消化性溃疡、炎症性肠病有关 [16] 。有研究显示肝癌患者肠道菌群变形菌门丰度增加，提示肝癌患者存在着一定程度的口腔菌群移位。在属水平上，与健康组相比肝癌组链球菌属显著升高，而梭杆菌属、拟普氏菌属、普氏菌属丰度显著降低。研究证实链球菌属的增加是肝癌进展过程中的驱动力 [17] [18] 。普氏菌属是革兰氏阴性菌，可在厌氧条件下生长。其通常被认为是一种与健康的植物性饮食相关的菌，在人体中发挥“益生菌”的作用。普氏菌属的减少与自闭症、过敏、多发性硬化症等疾病相关 [19] 。LEfSe分析与物种组成分析结果一致，综上所述，口腔菌群的改变可以为原发性肝癌的早期诊断提供参考。PICRUSt2菌群基因功能预测结果显示，与健康组相比，肝癌组在异生物素的生物降解和代谢途径、传染性疾病相关途径、肿瘤相关途径方面均升高。
慢性乙肝病毒感染患者，如乙型肝炎、乙肝肝硬化、肝癌患者对乙肝病毒的免疫应答减弱，受损的免疫系统对这种病毒的反应减弱导致了慢性感染 [20] 。患者免疫应答受损不仅发生在肝脏，也同样出现在身体的其它部位，例如口腔。有研究证实肝硬化患者口腔防御系统受损，炎症水平增高，IL-6、IL-1β和分泌型IgA较正常人升高，而溶菌酶、唾液肽Histatins-1和5降低 [21] 。Wang等 [22] 证实牙龈上微生物群的组成更多的受人体免疫状况影响，而非仅仅与齿龈炎、牙周炎有关。慢性乙肝病毒感染患者受损的免疫应答可能导致口腔菌群失调 [23] [24] 。由于这些患者口腔菌群失调，细菌能够轻易地突破受损的口腔防御系统，作为机会致病菌侵入胃肠道。这些细菌在肠道黏膜屏障受损时入血，引起TNF-α、IL-1、IL-6等炎症介质的释放，长期慢性炎症刺激加重肝脏功能及结构损伤，导致肝癌的发生。
本研究缺少慢性乙肝病毒感染各发病阶段的口腔菌群分析，查阅相关文献发现，Ling等 [25] 分析了10例慢性乙型肝炎患者和10例乙肝相关肝硬化患者的口腔菌群，发现两组口腔菌群极其相似，使用PCoA分析无法将两组区分开来。一个原因是10例乙肝相关肝硬化患者均处于代偿期，尚无肝性脑病、腹水等并发症，另一个原因是乙肝肝硬化患者在常年的慢性乙肝病毒感染过程中口腔菌群构成仅发生了轻微的改变。
口腔菌群方便提取易操作，通过高通量测序技术发现微生物群落的变化，推测其功能改变，可以用于预测疾病的发生和发展，为疾病的诊断提供参考。然而不可否认本研究仍存在诸多局限：首先，本研究仅分析了肝癌患者和健康者口腔这一特定部位的菌群构成，而研究对象的肠道菌群未能同时分析，因此，现有数据不足以建立起口腔菌群与肠道菌群的直接联系，只能推测出肝癌患者口腔菌群的关键种型改变可能导致肠道菌群的变化。其次，原发性肝癌和口腔菌群间的相关性及其中机制尚不明确，口腔菌群失衡是肝细胞癌的“因”还是“果”，还需进一步研究。再次，本研究未分析非乙肝病毒感染的肝癌患者口腔菌群构成，例如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝炎等。最后，本研究样本量较少，慢性乙肝病毒感染各阶段的大样本分析将使结果更具有说服力。
5. 结论
原发性肝癌患者存在口腔菌群失调，其中链球菌属丰度显著升高，梭杆菌属、拟普氏菌属、普氏菌属丰度显著降低，能够作为生物标志物辅助原发性肝癌的早期诊断。
NOTES
*通讯作者。