摘要: 目的：通过网络药理学和分子对接初步揭示了青蒿抗2型糖尿病的作用机制。方法：从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中根据OB值和DL值选出青蒿的有效成分和成分所对应的靶点，取青蒿和2型糖尿病的交集基因做PPI蛋白互作网络图，通过David数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析，最后采用分子对接验证。结果：筛选得到青蒿的活性成分22个、交集基因163个，通过蛋白互作分析发现“JUN、TP53、AKT1”治疗2型糖尿病的作用，KEGG富集发现，可能通过pathways in cancer、AGR-GAGE signaling pathway in diabetic complications、Lipid and atherosclerosis等信号通路进行调控。分子对接结果表明青蒿中的EUPATIN、isorhamnetin、sitosterol等活性成分与“JUN、TP53、AKT1”有非常强的结合能力。结论：青蒿可能是通过EUPATIN、isorhamnetin、sitosterol等成分调控pathways in cancer等相关信号通路上的JUN、TP53、AKT1等基因发挥治疗2型糖尿病的作用。
Abstract:
Objective: To preliminarily reveal the mechanism of action of Artemisia annua against type 2 dia-betes mellitus through network pharmacology and molecular docking. Methods: The active ingre-dients and corresponding targets of Artemisia annua were selected from the pharmacology data-base and analysis platform (TCMSP) of the Chinese medicine system according to the OB value and DL value, the intersection genes of Artemisia annua and type 2 diabetes mellitus were taken as PPI protein interaction network diagram, and the gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were analyzed through the David database, and finally the molecular docking was used for verification. Results: 22 active ingredients and 163 intersecting genes of Artemisia annua were screened, and the effect of “JUN, TP53 and AKT1” in the treatment of type 2 diabetes was found by protein interaction analysis, and KEGG enrichment was found, which may be regulated through pathways in cancer, AGR-GAGE signaling pathway in diabetic complications, Lipid and Signaling pathways such as atherosclerosis. The molecular docking results show that the active ingredients such as EUPATIN, isorhamnetin and sitosterol in Artemisia annua have a very strong binding ability with “JUN, TP53 and AKT1”. Conclusion: Artemisia annua may play a role in the treatment of type 2 diabetes mellitus by regulating JUN, TP53, AKT1 and other genes in related signaling pathways such as EUPATIN, isorhamnetin, sitosterol and other components.
1. 引言
随着人民生活作息方式的改变，慢性疾病变得越来越流行，比较凸显的是糖尿病，然而2型糖尿病患者是其发病的主要人群。2型糖尿病主要是由于环境因素(饮食习惯和生活习惯)和遗传因素所造成。由于疾病发生的整体性、多靶点和多通路的等特点与中医药整体观念、多成分和多作用层次相符合。
青蒿的主要化学成分主要有半萜、三萜、黄酮、香豆素和挥发油等，具有清热抗炎、调节免疫、抗疟疾杀虫等作用 [1] 。青蒿琥酯是青蒿素衍生物中的一种，能降低db/db小鼠的空腹血糖值和改善胰岛损伤修复胰岛素抵抗等作用 [2] 。青蒿素的衍生物之一双氢青蒿素(DHA)能调节相关通路上的蛋白表达从而去影响糖尿病小鼠的糖代谢、脂质代谢和胰岛素抵抗 [3] [4] [5] 。青蒿素还可以通过调节Nrf2通路上的血红素氧合酶1 (H0-1)蛋白去抑制铁死亡从而达到减少动脉粥样硬化 [6] 。本研究主要从青蒿的有效成分、作用靶点及相关通路，最后进行分子对接验证去揭示青蒿可能防治2型糖尿病的作用机制。
2. 材料与方法
2.1. 化学成分的建立
搜索网页TCMSP数据库 [7] (https://tcmsp-e.com/)草本选项里面检索“青蒿”设置筛选条件为OB (口服利用度) > 30、DL (类药性) > 0.18，用Uniprot数据库将靶点的蛋白名转化成标准的基因名格式。
2.2. 靶点的筛选与建立
利用GeneCards数据库 [8] (https://www.genecards.org/)在“Explore a gene”选项下以“Type 2 diabetes”为搜索指令，筛选出与2型糖尿病相关的基因靶点，将2型糖尿病的基因靶点和青蒿基因靶点导入Venny2.1.1网页绘制维恩图。
2.3. 关键靶点PPI网络构建
2.2步骤中的青蒿和2型糖尿病的交集靶点输入到String数据库 [9] (https://cn.string-db.org/)在线网页中的List of name列表中将Organisms选项中选为Homo sapiens (人类)选项，构建靶点互作网络图(PPI)，设置置信度为0.9，将蛋白互作图中前十蛋白筛选出来可视化分析，然后将青蒿–成分–靶点可视化分析。
2.4. GO生物过程富集分析和KEGG信号通路
第一步将青蒿-2型糖尿病的交集靶点导入DAVID数据库 [10] (https://david.ncifcrf.gov/)点击Analysis Wizard将共有基因复制到Gene List，第二步：在“select Identifier”–“official-gene-symbol”–“select species”–“Homo sapiens”，第三步：选择gene list，第四步：submit list。选择go和kegg，将下载的文件导入基迪奥专业测序服务 [11] (https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft)，选择工具–气泡图进行GO生物过程分析和KEGG的信号通路分析，结果以气泡图的形式展现。
2.5. 药物成分与靶点分子对接
将青蒿的22个活性成分文件夹导入SYBYL-X 2.0软件模板中进“compute-Minimize-Molecule”进行最小华，再用“Docking suit-Dock Ligands”指令将关键的三个蛋白JUN、TP53、AKT1与青蒿的22个有效成分分别进行一一对接，并同时应用软件设计去除水分、修复侧链和加氢并选择自动寻找活性位点。三个关键蛋白的结构下载于RCSB PDB数据库 [12] (https://www.rcsb.org/)。
3. 结果
3.1. 青蒿活性成分的筛选
通过TCMSP数据库草本选项检索“青蒿”总共得到青蒿化学成分126个，以OB ≥ 30、DL ≥ 0.18为筛选条件筛选出活性成分22个(如表1)：
Table 1. Qinghao active ingredient and target number
表1. 青蒿活性成分及靶标数
3.2. 青蒿和2型糖尿病相关靶点的筛选
结果如图1所示，共得到2型糖尿病的基因有15,861个其中score > 10得到2型糖尿病相关的靶点基因5300个，筛选得到青蒿活性成分22个，青蒿基因靶点和2型糖尿病靶点的交集基因共163个，其中的部分交集靶点有(如表2)：
Table 2. Partially intersecting targets
表2. 部分交集靶点
Figure 1. Qinghao active ingredient target and diabetes target intersection
图1. 青蒿活性成分靶点和糖尿病靶点交集
3.3. 青蒿抗2型糖尿病的直接作用靶点拓扑参数分析与成分靶点可视化
将青蒿和2型糖尿病的交集靶点导入String在线网页中，得到(如图2)，其中JUN (Degree = 39)、TP53 (Degree = 35)、AKT1 (Degree = 34)等综合排名靠前(表3)，可视化网络图中，节点代表着潜在目标、边代表靶点之间的相互作用，每个节点的边数被定义为“degree”即为度值。网络图中节点形状越大和颜色越深，说明此节点对应的相关靶点越重要，以边表示两个靶点之间的关联性，边越粗，靶点之间的关联越显著。如图3所示，是degree前十的十个蛋白相互作用的靶点图，3个红色为度最高的，说明这些青蒿靶点在治疗2型糖尿病中具有重要作用。图4即为青蒿–成分–靶点的可视化，根据筛选出的青蒿有效成分、青蒿和2型糖尿病交集靶点来做图，红色代表青蒿，紫色代表青蒿有效成分，珊瑚荧光色代表青蒿与2型糖尿病的交集靶点。依据图示，青蒿可能通过这些有效成分作用于靶点蛋白发挥药效作用。
Figure 2. Protein interaction network diagram
图2. 蛋白互作网络图
Figure 3. Top ten target protein interaction map
图3. 前十靶点蛋白互作图
Figure 4. Qinghao-Ingredient-Target Network Map
图4. 青蒿–成分–靶点网络图
3.4. GO生物学功能富集分析
在David数据库网页中导入青蒿和2型糖尿病的交集基因163个，选择其中GO生物过程(biological process, BP)富集分析共得到生物学富集结果751条，将其中的前20条生物过程富集以气泡图的形式展现，如图5即：RNA聚合酶II前驱体转录正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promotor)为最显著的生物过程图5中右边可以看到P值越小气泡越大富集程度越高该生物过程发生的可能性更大。
3.5. KEGG通路分析
将163个青蒿与2型糖尿病交集基因导入David数据库，选择KEGG信号通路分析，将得到信号通路178条，前20条通路进行展示如图6，P值越小气泡越大颜色越红富集程度越高。其中前5条通路包括：癌症通路类(pathways in cancer)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGR-GAGE信号通路(AGR-GAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力和动脉粥样硬化Fluid shear stress and atherosclesis、乙型肝炎(Hepatitis B)、这些通路大多此三个蛋白靶点JUN、TP53、AKT1有关。
Figure 5. Bubble plot of biological functional enrichment results
图5. GO生物学功能富集结果气泡图
Figure 6. KEGG enrichment result bubble plot
图6. KEGG富集结果气泡图
3.6. 分子对接结果
根据以上结果选择了度值排名前三的蛋白与青蒿活性成分进行对接Total Score ≥ 5为筛选条件 [13] ，总打分值大于5，说明青蒿有效成分和关键蛋白已经有很强的结合了，选择Total Score ≥ 8作为最高分数，筛选对接结果较好的化学成分，总打分值越高，结合越稳定(见图7)。图8分子对接结果发现，其中DMQT与关键蛋白TP53的结合分数最高为8.107，说明其与蛋白结合最紧密，这些化合物在抗2型糖尿病中可能发挥着重要作用。
Figure 7. Molecular docking visualization
图7. 分子对接可视化
4. 讨论
目前关于修复胰岛细胞或缓解胰岛素抵抗是最新的治疗2型糖尿病的思路。
青蒿，具有清热解毒、泄火退黄、杀虫截疟等的作用，其作用机制可能是通过调控p38MAPK通路上的IL-6蛋白 [14] 。青蒿素及其衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚能降低炎症因子的表达，如IL-6，其中青蒿琥酯抗炎效果最好且青蒿素能降低糖尿病小鼠模型的体重 [15] 。根据PPI拓扑网络分析前十的作用蛋白JUN、TP53、AKT1、RELA、MAPK1、TNF、ESR1、MAPK14、FOS、IL6，其中前三个关键蛋白：c-jun氨基末端激酶(c-jun, N-terminal kinase JNK) JNK能调节炎症、凋亡和自噬等过程，且JNK信号通路在糖尿病的发生发展过程中起着重要作用 [16] ，JNK能减轻胰岛素抵抗和β细胞损害，因此可以作为治疗糖尿病的潜在目标，JNK表达下调后，小鼠血糖水平明显降低并且胰岛素的敏感性提高 [17] 。TP53 (tumor蛋白53)，是肿瘤蛋白编码P53蛋白，抑癌蛋白之一，能调节P21和BCL-2等相关的蛋白基因，广泛的参与细胞凋亡和DNA修复等各种重要的生物过程 [18] ，TP53基因突变是人类肿瘤癌变中最常见的基因突变之一。AKT1 (丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)，是蛋白激酶B系中的其中一类，另外还有AKT1、AKT2，AKT3等也被发现在胰腺癌中发挥了作用 [19] 。通过蛋白互作筛选出10个关键蛋白，将青蒿有效成分与关键蛋白结合，其中15个有效成分分别于JUN、TP53、AKT1三个关键蛋白都有比较强的结合，其中最强的结合是DMQT与TP53蛋白的结合。GO富集分析发现最显著的是RNA聚合酶II前驱体转录正向调控过程，此过程涉及炎症反应、细胞凋亡等产生的炎症因子会加剧细胞黏附，产生胰岛素抵抗，在T2DM过程RNA聚合酶II前驱体转录正向调控表达会上调DEGs [20] ，是可能发挥抗2型糖尿病的生物过程，KEGG通路富集分析糖尿病最可能发生的通路是癌症类通路，其中T2DM与癌症类PI3K-AKT信号通路 [21] 有关，发现通路上的mTOR水平在癌症和T2DM上表达上调，在胰岛组织中表达下调，说明T2DM和癌症激活了PI3K-AKT通路上的相关蛋白，则治疗T2DM要抑制通路上的蛋白，同时癌症类通路中的JNK信号通路和STAT3信号通路也可能发挥了治疗2型糖尿病的作用。其中青蒿的DMQT、异鼠李素和柽柳黄素等有效成分可能通过pathways in cancer上的JNK、AKT和TP53关键蛋白发挥了治疗2型糖尿病的作用。
本研究以网络药理学、分子对接为基础阐释了青蒿初步可能防治2型糖尿病的作用蛋白靶点、有效成分及通路，为进一步探究2型糖尿病的作用机制提供理论基础。
基金项目
国家自然科学基金项目(82060824)；贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK [2022]一般460)；贵州省基础研究计划项目(黔科合基础-ZK [2022]一般512)；贵州省中医药调控肠道菌群防治重大疾病科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020] 5010)；《医养结合服务模式与规范的应用示范》(2020YFC2006000)。
NOTES
*通讯作者。