三四脯氨酸(TTP)对真菌性角膜炎中炎症反应的影响

Effect of Tripetraproline (TTP) on Inflammatory Reaction in Aspergillus fumigatus Keratitis

摘要: 目的：探讨三四脯氨酸(Tristetraprolin, TTP)对小鼠烟曲霉菌性角膜炎中炎症反应的影响。方法：体外实验用烟曲霉菌菌丝感染RAW264.7细胞后，用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞中不同时间段TTP、IL-1β、TNF-α、IL-6和CCL-2的mRNA表达。使用靶向TTP表达的短干扰RNA (TTP siRNA)或乱序干扰RNA (scrambled RNA)处理，干扰TTP的表达。RT-PCR检测干扰TTP表达后烟曲霉菌诱导的RAW264.7中IL-1β、TNF-α、IL-6，CCL-2的mRNA的表达。结果：TTP在烟曲霉菌刺激的RAW264.7细胞中表达增加，TTP siRNA可以抑制RAW264.7细胞中TTPmRNA的表达，干扰TTP的表达增加了烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞炎症反应中的IL-1β、IL-6和CCL-2的表达。结论：TTP抑制烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达。

Abstract: Objective: To explore the effect of Tristetraprolin (TTP) on Aspergillus fumigates (A. fumigatus) ker-atitis in mice. Methods: After RAW264.7 cells were infected with Aspergillus fumigatus mycelium in vitro, the expression of TTP mRNA in RAW264.7 cells was detected by RT-PCR. Then, RAW264.7 cells were treated with short interfering RNA (TTP siRNA) targeting TTP expression or out-of-order interfering RNA (scrambled RNA) and the mRNA expression of TTP, IL-1β, TNF-α, IL-6 and CCL-2 by RT-PCR. Results: The expression of TTP increased in RAW264.7 cells stimulated by Aspergillus fu-migatus. TTP siRNA could inhibit the expression of TTP mRNA in RAW264.7 cells. Interfering the expression of TTP increased the expression of IL-1β, IL-6 and CCL-2 in the inflammatory reaction of RAW264.7 cells induced by Aspergillus fumigatus. Conclusion: TTP can inhibit the expression of in-flammatory factors in RAW264.7 cells induced by Aspergillus fumigatus.

1. 引言

真菌性角膜炎(Fungal keratitis, FK)是一种严重的威胁视力的疾病，发病率及失明率很高，占传染性角膜炎的1%~45% [1] [2] 。真菌性角膜炎的易感因素包括角膜外伤、既往角膜手术史、慢性眼表疾病、局部或全身皮质类固醇使用、佩戴隐形眼镜以及免疫抑制性疾病，如获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) [3] [4] 。常见的致病真菌包括霉菌属、镰刀菌属、弯孢菌属和念珠菌属。镰刀菌和曲霉菌在自然界中广泛存在，是免疫功能低下人群患严重疾病的常见病原体 [5] ，也是眼部感染尤其是角膜炎的重要病原体 [6] 。那他霉素和两性霉素B分别是丝状真菌性角膜炎和酵母菌性角膜炎治疗的首选。三唑类伊曲康唑和氟康唑也逐渐成为眼部真菌病的治疗方案 [6] 。但由于对治疗的反应不佳以及抗真菌剂的效用性有限 [7] ，大约10%真菌性角膜炎患者会出现角膜穿孔，超过60%的患者即使治疗也会永久丧失视力 [8] 。因此，真菌性角膜炎的诊治是眼科医生遇到的最棘手的问题之一。

在真菌性角膜炎的发病过程中，真菌与宿主接触，真菌可被宿主上皮细胞和免疫细胞上表达的模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRR)识别，PPR包括Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs，包括TLR2和TLR4)、C型凝集素受体(CLR)和核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NLRs)。这些PPR的表达和激活增加了炎症细胞因子的分泌，如IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL-2，这些炎症因子的变化可以影响真菌性角膜炎的发生和发展。已有研究证实，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)可以募集白细胞并增强其抗真菌活性 [9] [10] ，单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1/CCL-2)是调节单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子之一，可以通过与其特异性受体CCR2结合加速巨噬细胞迁移至感染病灶 [11] 。在侵袭性肺曲霉病动物模型中，TNF-α、MCP-1表达水平升高，而这些趋化因子和促炎细胞因子的中和将导致真菌清除率降低，进而导致死亡率升高 [10] 。结核分枝杆菌感染后，Mincle (-/-)小鼠与野生型小鼠相比，突变小鼠细菌负荷更高且表达更高水平的促炎细胞因子，如白介素-1β (IL-1β)，加重炎症反应，表明IL-1β可能与炎症的严重程度相关 [12] 。CXC趋化因子配体2 (CXCL-2)是趋化中性粒细胞的重要因子，通过CXC趋化因子受体2 (CXCR2)发出信号，激活中性粒细胞 [13] ，参与中性粒细胞的粘附、爬行和迁移过程。现有研究证明，真菌性角膜炎中IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL-2、CXCL-2表达升高，抑制促炎细胞因子和趋化因子表达会减轻过度炎症反应，TTP是RNA结合蛋白家族的成员，通过与其靶mRNA的3’端非翻译区域中富含腺苷–尿苷(AU)的元素(ARE)结合，进而去除转录物的poly(A)尾并最终导致其快速降解 [14] 。研究证实，TTP在调节炎症 [15] [16] [17] 、细胞凋亡 [18] [19] [20] 、肿瘤发生 [21] 、组织发育和铁代谢 [22] 中发挥重要作用。目前已有研究证明TTP在炎症反应过程中上调，促进促炎细胞因子mRNA的快速降解，阻断促炎基因表达，在慢性炎症性疾病中发挥抗炎作用，如在神经系统疾病(包括阿尔茨海默病、多发性硬化症、缺血后神经变性、脑肿瘤等)中，星形胶质细胞在脑组织炎症反应的调节中发挥着重要作用 [23] [24] ，炎症刺激时，星形胶质细胞中TTPmRNA表达增加，通过ARE介导的mRNA衰变调节炎症反应，被认为是神经炎症的治疗靶点 [25] 。在慢性阻塞性肺疾病动物模型中，与对照组(野生型小鼠)相比，实验组小鼠(基因突变型小鼠，内源性TTP无法磷酸化，使其作为mRNA失稳因子具有组成性活性)暴露于香烟烟雾4天后，小鼠气道中性粒细胞和淋巴细胞的数量以及细胞因子的mRNA表达水平降低。实验组小鼠的肺部炎症、气道重塑和肺气肿样肺泡扩大减少，肺功能得到改善。在自身免疫性(非感染性)葡萄膜炎动物模型中，TTP△ARE小鼠(去除TTP富含AU元素(ARE)的不稳定基序，是一种TTP过表达小鼠)对光受体间类视黄醇结合蛋白(Interphotoreceptor retinoid binding protein, IRBP)诱导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental Autoimmune Uveitis, EAU)具有抵抗力，淋巴细胞产生的促炎细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-6和TNF-α水平低于野生型小鼠 [26] 。但尚未有研究证明其在真菌性角膜炎中的抗炎作用，本文将针对TTP在烟曲霉菌诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症中的表达及抗炎作用进行研究。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

RAW264.7细胞系从中国科学院(上海)获得。TTP siRNA及scrambled siRNA购自广州锐博生物技术有限公司。

2.2. 烟曲霉菌的培养

将标准烟曲霉菌菌株3.0772 (中国普通微生物菌种保藏中心，中国北京)接种于沙氏培养基，置于于37℃恒温箱培养，待其生长至合适范围后，用含有0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)冲洗培养基获得分生孢子，重复离心(12,000 rpm, 5分钟)、弃上清、重悬得到分生孢子悬浮液，4℃保存。将标准烟曲霉菌菌株接种于经过高压消毒后的含300 ml Sabouroud液体培养基的无菌烧瓶内，纱布严密包扎瓶口。置于摇床培养箱(37℃, 120 rpm)中培养。当菌丝生长至团块状时，收集菌丝并研磨，PBS洗涤、离心(4℃、4500 rpm、10分钟)、弃上清。菌丝中加入75%的酒精吹打混匀后置于4℃冰箱过夜灭活菌丝。次日PBS洗涤后加入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)用于将烟曲霉稀释至1 × 10⁸ CFU/ml。灭活的烟曲霉菌丝体储存在−20℃。

2.3. RAW细胞处理

将接种于12孔板中的RAW264.7细胞于温箱培养至接近80%融合，无菌PBS洗涤并更换培养液，2小时后加入5 × 10⁶ CFU/mL烟曲霉菌灭活菌丝刺激细胞，分别处理6、9、12、16小时，采用RT-PCR实验，检测不同时间段TTP、IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL-2的mRNA表达水平。

将接种于12孔板中的RAW264.7细胞于温箱培养至接近50%融合，无菌PBS洗涤并更换培养液，加入TTP siRNA (50 nM)或scrambled siRNA (50 nM)预处理40小时，给予灭活烟曲霉菌菌丝刺激，感染9小时后收集细胞用于RT-PCR实验，检测TTP、IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL-2的mRNA表达水平。

2.4. RT-PCR

2.4.1. Total RNA的提取

将含有RAW264.7细胞的RNA裂解液(500 uL)的EP管置于冰盒上裂解30分钟。4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液入另一新的EP管中，加入与RNA裂解液1/5体积量相等(100 uL)的三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温放置5分钟后，4℃、12,000 rpm离心15分钟，液体分为三层，取上层液体于新的EP管中；向装有上清液的EP管中加入异丙醇(200 uL)，上下颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃上清得到RNA沉淀。加入500 μL 75%乙醇，上下颠倒混匀充分洗涤沉淀，4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃上清，待乙醇挥发。向EP管中加入DEPC水，充分离心–振荡–离心，使RNA沉淀溶解，随后立刻测定RNA的含量及纯度。

2.4.2. Total RNA含量及浓度测定

将核酸蛋白分析仪的OD值(optical density, OD)调零，从以上EP管内吸取1 μl样本，分别测样本在260 nm、280 nm处的OD值以及OD 260/OD 280比值，测量三次取平均值。根据测得的数值计算所需的样本溶液体积。

2.4.3. 逆转录

总RNA通过使用用于qRT-PCR的HiScript III RT SuperMix (Vazyme Biotech，中国南京)逆转录获得cDNA。

2.4.4. PCR

将cDNA配置成20 µL混合待测液，置PCR仪上进行基因扩增反应。条件为：95℃ 30 s (预变性) → 95℃ 45 s (变性) → 60℃ 30 s → 95℃ 15 s (退火、延伸) → 60℃ 30 s → 95℃ 15 s (溶解)。反应结束后，根据内参，计算目的基因mRNA相对表达量。引物序列见表1。

Table 1. Primer sequence of target gene

表1. 目的基因引物序列

F, forward; R, reverse.

2.5. 统计学方法

GraphPad Prism (美国GraphPad Prism软件)作为分析软件。两组间临床评分差异采用Mann-Whitney U检验。所有数据均以独立实验的平均值 ± 标准差表示。通过未配对的双尾t检验分析qRT-PCR数据。^*P < 0.05、^**P < 0.01、^***P < 0.001被视为有统计学意义。所有实验至少进行三次以确保准确性。

3. 结果

3.1. TTP和炎症因子在烟曲霉菌刺激的RAW264.7细胞中的表达

我们检测了TTP及炎症因子在正常未感染RAW264.7细胞和烟曲霉处理后不同时间段RAW264.7细胞中的表达(图1(a)~(e))。RT-PCR显示，与正常未感染组相比，TTPmRNA在烟曲霉感染的RAW264.7细胞中的表达在6、9、12、16小时显著增加，在9小时达到峰值。RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL-2的mRNA表达均在烟曲霉菌刺激后上调。

注：(a)烟曲霉菌感染RAW264.7细胞不同时间后TTP的mRNA表达变化，在6、9、12、16小时显著增加，在9小时达到峰值；(b)~(e)烟曲霉菌感染RAW264.7细胞不同时间后IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL-2的mRNA表达增加(n = 6组)(^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001)。

Figure 1. The mRNA expression of TTP、IL-1β、TNF-α、IL-6 and CCL-2 in RAW264.7 cells treated by Aspergillus fumigatus hypha.

图1. 烟曲霉菌菌丝刺激RAW264.7细胞后TTP以及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和趋化因子CCL-2的mRNA表达

3.2. TTP siRNA抑制RAW264.7细胞中TTP的表达

采用TTP siRNA预处理RAW264.7细胞，然后烟曲霉菌感染细胞。采用RT-PCR法检测正常组(N)、烟曲霉菌处理组(AF)、烟曲霉菌 + TTP siRNA组(TTP siRNA + AF)以及烟曲霉菌 + scrambled siRNA组(scrambled siRNA + AF) TTP的mRNA表达变化，验证干扰效率。RT-PCR结果显示(图2)，与烟曲霉菌处理组相比，烟曲霉菌 + TTP siRNA组中TTPmRNA表达显著下降，差异有统计学意义；烟曲霉菌 + scrambled siRNA组TTPmRNA表达无明显变化。以上实验结果表明，TTP siRNA成功干扰烟曲霉菌诱导的RAW细胞中TTP的表达。

注：TTP siRNA预处理组和scrambled siRNA预处理组烟曲霉菌感染9 h后，与烟曲霉菌处理组相比，烟曲霉菌 + TTP siRNA组中TTPmRNA表达显著下降，差异有统计学意义；烟曲霉菌 + scrambled siRNA组TTPmRNA表达无明显变化(n = 6组) (^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001，ns差异无统计学意义)

Figure 2. The down-regulation effect of TTP siRNA pretreatment on TTP mRNA expression in RAW264.7 cells induced by Aspergillus fumigatus

图2. TTP siRNA预处理对烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞中TTP的mRNA表达的下调作用

3.3. TTP在基因水平抑制烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞炎症因子的表达

为进一步验证TTP是否通过影响炎症因子和趋化因子发挥抑炎作用，采用RT-PCR实验检测TTP siRNA处理对感染后RAW264.7细胞中炎症因子和趋化因子表达的影响。RT-PCR的结果显示，烟曲霉菌感染RAW264.7细胞组中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和趋化因子CCL-2表达量都较正常组有明显升高，差异均有显著统计学意义(图1(b)~(e))，说明烟曲霉菌诱导了RAW264.7中炎症的发生。与烟曲霉菌感染组相比，TTP siRNA加菌感染组中的炎症因子IL-1β、IL-6和趋化因子CCL-2的mRNA表达水平显著升高(图3(a)、图3(c) &图3(d))，差异有统计学意义；而炎症因子TNF-α的mRNA表达水平无明显变化(图3(b))。说明TTP可以抑制烟曲霉诱导的炎性因子IL-1β、IL-6和趋化因子CCL-2的产生，减轻炎症反应。

4. 讨论

真菌性角膜炎在世界范围内通常是一种难治性且具有挑战性的眼科疾病 [27] [28] 。炎症是针对入侵病原体或组织损伤的免疫反应的重要组成部分。病原体相关模式(PAMP)通常识别巨噬细胞模式识别受体(PRR)构成机体防御的第一道防线 [29] [30] ，同样，组织损伤通过损伤相关分子模式(DAMP)激活PRR，迅速募集嗜中性粒细胞，这些嗜中性粒细胞是促炎反应的先锋 [31] [32] [33] ，从而引发局部炎症反应。虽然炎症反应对清除病原体、增强机体抵抗力起到有利的作用，但持续的高反应性炎症环境导致过度的组织损伤，加重疾病的进展。然而，目前临床上仍缺乏安全有效的治疗药物，导致真菌性角膜炎导致的角膜穿孔率比细菌性角膜炎高5至6倍，因此迫切需要找到治疗此类疾病的新方法。

注：(a)~(d)下调TTP的表达烟曲霉菌感染RAW264.7细胞9 h，细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和趋化因子CCL-2的mRNA表达水平显著升高，TNF-α的mRNA表达水平无明显变化(^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001，ns差异无统计学意义)

Figure 3. The effect of TTP on inflammatory factors IL-1β, TNF-α, IL-6 and chemokine CCL-2 in RAW264.7 cells induced by Aspergillus fumigatus

图3. TTP对烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和趋化因子CCL-2的影响

TTP存在于大多数真核生物中，是一种核质蛋白，可结合细胞质中含有ARE的mRNA并促进其降解，是重要的抗炎和促分解因子 [34] [35] [36] ，在细胞代谢、基因表达、炎症、癌症中发挥重要作用 [37] 。TTP所具备的抗炎作用已在多种疾病模型中被证实，例如TTP基因敲除小鼠会出现严重的关节炎、自身免疫、恶病质、皮炎和骨髓增生综合症 [15] ；在慢性阻塞性肺疾病中，TTP通过降低促炎细胞因子和趋化因子的表达，减少中性粒细胞的募集，进而在抑制香烟烟雾诱导的肺部炎症、气道重塑、肺气肿和肺功能受损方面发挥着重要作用 [38] ；在模拟的炎症性关节炎模型中，当TTP表达受到抑制时，MSU晶体处理的J774A.1细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA表达相应增加 [39] 。我们的研究结果证实，TTP 在烟曲霉菌菌丝刺激的RAW264.7细胞中表达，且在感染9 h后出现表达高峰。烟曲霉菌成功诱导的RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL-2的基因表达升高，引发炎症反应，干扰TTP表达后可使炎症因子IL-1β、IL-6及趋化因子CCL-2表达增加，表明在炎症反应过程中，TTP可以抑制RAW264.7细胞中炎症因子的表达，减轻炎症反应，发挥抗炎作用。

5. 结论

综上所述，本实验证实了TTP在真菌性角膜炎中的抗炎作用与其抑制下游炎症因子及趋化因子表达有关。但是，关于TTP在真菌性角膜炎中发挥抗炎作用的具体机制尚未明确，我们会针对其发挥抗炎作用的具体机制进行更加深入的研究。为TTP作为治疗真菌性角膜炎的新靶点奠定基础。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]