肝细胞癌微环境研究进展及临床意义

Progress in the Study of Hepatocellular Carcinoma Microenvironment and Its Clinical Significance

摘要: 肝癌已成为全球最高发的癌症之一，在我国，它的死亡率高居第二位，在全球占据第四位。肝癌中肝细胞癌( Hepatocellular Carcinoma, HCC)占比最高。肝切除术被认为是HCC患者最佳的治疗选择，其重要性不容忽视。但此方法适用于早期肝脏肿瘤并且手术后复发率极高。我国肝癌诊断多为晚期无法直接进行手术治疗，因此HCC的预后非常差。近年来，肝癌的免疫治疗延长了患者的生命，由于新的治疗方法多是基于肝细胞癌肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的，因此有必要阐明HCC的肿瘤微环境。在本综述中，我们总结阐述了HCC肿瘤微环境特征，HCC免疫微环境(tumour immune microenvironment, TIME)五个亚型及与预后的关系，HCC微环境免疫网络，当前针对免疫微环境的治疗以及临床常用HCC微环境指标。

Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common subtype of liver cancer which ranks fourth in terms of global cancer mortality and second in terms of tumor-related mortality in our country. While surgical resection is the current preferred treatment for liver cancer, it is only suitable for early-stage liver tumors and has an extremely high recurrence rate. Diagnosis of liver cancer in our country is mostly at a late stage, making it difficult to receive direct surgical treatment, resulting in a very poor prognosis for HCC. In recent years, immunotherapy for liver cancer has extended the life of patients. Since new treatment methods are mostly based on the tumor microenvironment (TME) of hepatocellular carcinoma, it is necessary to clarify the TME of HCC. In this review, we summarize and elaborate on the TME characteristics of HCC, the five subtypes of the tumour immune microen-vironment (TIME) of HCC and their relationship with prognosis, the immune network of the HCC mi-croenvironment, and the current treatments targeting the immune microenvironment, as well as the commonly used HCC microenvironment indicators in clinical practice.

1. 引言

肝癌的发病率在全球范围内增加，不仅在欧洲和美国，而且在我国也是如此。最新报告表明肿瘤性疾病中肝癌发生率在前六名，死亡比率在第四名，而在我国死亡率排第二 [1] [2]。HCC是一种极为常见的病理类型，在原发性肝癌中患者数量超过90% [3]。由于诊断晚、对化疗的抵抗力强、复发和转移频繁，HCC的预后非常差，在欧美和我国5年生存率为15%~38% [4] [5] [6]。

当前肝细胞癌首选的治疗方案仍然是手术切除，而针对不可切除的HCC可采用局部及系统治疗方法。Ann-Lii Cheng等人，将226名患者被随机分配到实验组或安慰剂组。进行索拉非尼治疗的HCC患者的中位总生存期为6.5个月明显高于安慰剂组的4.2个月。该实验证实了分子靶向药物(MTAs)索拉非尼，能够显著延长无法切除的肝癌患者的生存期 [7]，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抑制剂也被广泛应用于临床治疗 [8]。近年来，分子靶向药物的研发和应用已经变得非常广泛，尤其是针对HCC的免疫检测点抑制剂(ICIs)的治疗，取得了显著的进步，发展迅猛。对于晚期 HCC，ICIs 和 VEGF 联合使用比索拉非尼单用有更好的预后 [9]。虽然HCC的系统治疗已经经历了重大的转变，但晚期HCC的治疗仍然不充分。现有系统疗法都取决于肿瘤微环境，因此有必要阐明HCC的肿瘤微环境，以期望改进当前的治疗策略，在未来能提高HCC患者的预后。

肿瘤微环境(TME)主要有癌细胞，各种免疫细胞、基质细胞、内皮细胞以及癌症相关的成纤维细胞(Cancer-Associated Fibroblasts, CAF)。免疫细胞又包括T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞等TME与肿瘤组织的形成、存活和转移密切相关 [10]。

2. 肝细胞癌肿瘤微环境

2.1. HCC肿瘤微环境特征

肝脏是参与人体重要的免疫反应也是主要组成部分，早在2006年就有研究认为肝脏是免疫器官 [11]。肝细胞癌微环境内的免疫细胞与肿瘤通过互作用，形成了一种独特的肿瘤免疫微环境，其中包括抗肿瘤细胞、促肿瘤细胞以及受争议的细胞。抗肿瘤细胞主要由T细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(Dendritic Cells, DC)和M1巨噬细胞组成，它们可以有效地抑制肿瘤的生长和发展，从而提高患者的生存率和预后。调节性细胞(Tregs)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、CAF和M2巨噬细胞，这四个都是促肿瘤细胞，都可以促进肿瘤的发生发展为HCC患者带来较差的预后；当前有争议的癌症免疫细胞类型：B细胞 [12]。

2.2. HCC免疫微环境亚型

肿瘤免疫微环境的是导致肿瘤转移、复发和耐药性的主要因素 [13]，但不同的TIME亚型与肝癌的临床相关性如何仍不清楚。Xue R等人关于肿瘤免疫微环境的研究，对189个样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。此样本取自124名HCC患者和8只实验老鼠，最终通过分析100多万个细胞将HCC患者的TIME可分为五个不同的类别：激活、抑制、排斥和驻留。这些类别可能会影响患者的生命周期，并且可能会对治疗产生重要影响。

分型依据以下几个方面：细胞集群、功能标记基因表达、与TIME相关的基因特征、预后的相关性。五个亚型的特征与预后关系如下 [14] ：

免疫激活型(immune activation, TIME-IA)：含有活化的髓样细胞和T细胞簇，HCC患者表现出免疫激活状态。

免疫抑制性髓样细胞型(immune suppressive myeloid, TIME-ISM)：富含“髓样细胞免疫抑制”和“促肿瘤细胞因子”的特征，共同表现出的免疫抑制和促肿瘤特性。与较差的预后相关。

免疫抑制性基质型 (immune suppressive stromal, TIME-ISS)：富含“基质”和“癌症相关成纤维细胞”的特征，与较差预后的关联。

免疫排斥型 (immune exclusion, TIME-IE)：包含大多数内皮细胞和间质细胞群，但缺乏免疫细胞。特别是富集的成纤维细胞可以将T细胞从肿瘤细胞中排除 [15]。

免疫驻留型 (immune residence, TIME-IR)：包含肝脏驻留细胞群，包括居住的NK细胞、Kupffer细胞和肝窦内皮细胞。与更好的预后有关。

2.3. HCC肿瘤微环境免疫网络

HCC的肿瘤微环境的组成复杂，它们在肿瘤发生和发展过程中发挥着至关重要的作用，是肿瘤治疗的关键因素 [16]。而这个复杂免疫微环境系统主要包括七个步骤，即HCC的癌症–免疫循环七步： 1) 癌细胞增生坏死或治疗死亡释放抗原。2) DCs可以捕获和吞噬肿瘤细胞，并将它们转移到淋巴结。3) DCs可以消化肿瘤细胞的抗原，并将这些信息传递给CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。(d) T细胞迁移到HCC组织。4) T细胞浸润到癌细胞中。5) T细胞通过识别HCC细胞上的T细胞受体(TCR)然后与其结合。6) HCC细胞被T细胞杀死 [17]。

M1巨噬细胞诱导的肿瘤坏死因子(TNF)-β和白细胞介素(IL)-12，自然杀伤(NK)细胞产生的干扰素(IFN)-γ，CTL分泌的IL-2都可以进一步激活T细胞。免疫循环具备负反馈机制；当过度抑制时，循环会随着癌症免疫反应的放大而停止。早在1995年就有研究显示当小鼠CTLA-4缺陷时，所有T细胞亚群激活和大量T细胞增殖 [18]。Daniel L Barber等人在小鼠体能通过阻断无功能CD8+ T细胞的PD-1/PD-L1抑制性途径，恢复了CD8+ T细胞的增殖和免疫功能 [19]。上述两个实验证明了CTL相关蛋白-4 (CTLA-4)、PD-1都可以抑制T细胞的活性，从而有效地阻止免疫反应的过度发生。

3. 当前针对肝细胞癌肿瘤微环境的治疗

3.1. 分子靶向药

近年来，索拉非尼作为一种分子靶向治疗技术，在晚期HCC患者的治疗中取得了成果显著。它具有强大的抗肿瘤活性，抑制血管内皮生长因子和血小板源性生长因子的表达是其发挥抗癌作用的关键，有效地延长HCC患者的总生存期以及无法复发生存期。乐伐替尼(Lenvatinib)具有显著的抗炎作用，它能够有效地阻断VEGFR1-三、FGFR、PDGFRα以及酪氨酸激酶受体的表达，进而阻断新生血管的形成与发育，并且显著降低血液的渗透性和TMEs [20]。有根据最新的研究结果，乐伐替尼和索拉非尼都具有良好的抗癌作用。乐伐替尼的总体生存时间(OS)与索拉非尼的相比，其有效性、疾病控制能力以及无进展生存时间(PFS) [21] 均优于索拉非尼。身体无法耐受索拉非尼或乐伐替尼的以及无法进行手术切术的HCC的二线治疗包括瑞戈菲尼(Regorafenib)、卡博替尼、舒尼替尼、利尼伐尼 、布立尼布和替万替尼(Tivantinib)，其靶向酪氨酸激酶及其相关通路 [22]。

3.2. 免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs)

ICIs免疫疗法改变了HCC辅助治疗仅使用分子靶向药的治疗模式，改善了HCC晚期患者或有肝外转移患者的治疗结果。一项有关替西木单抗单克隆抗体药物研究显示：晚期HCC患者使用替西木单抗(Tremelimumab)治疗后部分反应率为17.6%，疾病的控制率高为76.4%。疾病进展时间约为6.5个月 [23]。纳武单抗(nivolumab)是全球首次针对PD-1的单克隆抗体药物。Dr Anthony B El-Khoueiry，等人关于262例HCC患者的研究，显示在使用纳武单抗治疗的患者的客观缓解率显著高达20% [24]。ICIs抗肿瘤效果显著，目前关于ICIs的研究仍在进行中。

4. 肝细胞癌微环境临床常用指标

4.1. Ki-67

Ki-67是一种蛋白，目前已经确定与肿瘤细胞的生长和增殖相关。Ki-67与HCC术后复发率呈现正相关，2021年一项Ki-67与HCC肝移植术后复发率的研究得出结果：在HCC复发组37名患者和对照组23名患者的术后HCC样本中，Ki67的阳性表达率分别为67.5%和39.1% [25]。

Ki-67与HCC的总生存期有关。在2023年Xihua Yang等人研究证明Ki-67在HCC中的表达与一些临床病理参数高度相关如：AFP ≥ 400 ng/ mL (P = 0.015)、肿瘤大小 ≥ 5 cm (P = 0.012)、肿瘤包膜不全(P < 0.001)、MVI (P = 0.001)、PVTT (P = 0.003)、BCLC晚期(P = 0.01)、VCE。该研究显示20个月生存率Ki-67高表达组(>50%)为12.8%、低表达组为31.8% [26]。在HCC中Ki67高表达与患者的总生存期呈负相关。Ki-67常规检测方法是基于细胞染色比的免疫组化，当前使用CT及其他影像学方法预测Ki-67的研究很有潜力。

4.2. 微血管密度(Microvessel Density, MVD)

HCC是实体肿瘤中血管化程度最高的肿瘤之一，主要血管改变表现为肝窦毛细血管化和动脉化。MVD是实验室和临床评估血管新生的标准方法，也与HCC的预后相关。2006年Qing Zhang，等人对HCC肝移植术后患者MVD做评估得出肿瘤组织中高MVD与无复发生存率呈负相关 [27]。近些年研究未发现肿瘤内MVD与总生存率和无复发生存率有显著关系 [28]。当前对测量MVD来进行预后的预测仍存在争议。MVD可以用来判断索拉非尼和乐伐替尼等具有强抗血管生成能力药物治疗效果的评价 [29]。因此我们认为肝癌组织中血管生成的测量可能对肝癌的预后和治疗具有重要意义。

5. 结论与展望

微环境的变化会影响肿瘤的发展，因此，利用分子靶向技术、ICIs技术以及其他免疫疗法，可以大大改善微环境，从而提高患者的生存率，并且在临床上取得良好的效果，成为一种重要的抗癌辅助治疗方式，并成为继传统的化疗、放疗和手术治疗后进一步改善HCC预后的治疗。但目前免疫治疗替代传统化疗治疗尚为时过早，在临床应用过程中还有很长的路要走。Ki-67除了肿瘤细胞的生长和增殖相关还代表着较高的术后复发率与较短总生存期。MVD对于HCC预后的预测仍有争议可能收试验的混杂因素影响，进行严格设计的研究是必要的。HCC作为预后较差的肿瘤之一，对于微环境的细胞及非细胞成分的研究远远不够需要我们继续研究探索来寻找更多替代或补充传统治疗的方法。

NOTES

^*通讯作者。