1. 引言
干眼(dry eye disease, DED)是一种由多种致病因素引起的常见眼表疾病，其致病因素包括泪液分泌异常、泪膜不稳定和炎症 [1] 。干眼可引起眼部不适、干涩、眩光、视力模糊等症状，影响人们的生活质量。结膜杯状细胞是眼表主要的分泌细胞，可分泌黏蛋白MUC5AC等润滑眼表上皮细胞，稳定泪膜，阻挡病原体渗透 [2] [3] 。干眼患者的结膜杯状细胞数量减少，黏蛋白MUC5AC分泌含量下降 [4] ，导致泪膜稳定性降低，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌增多 [5] 。
芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)是螺旋–环–螺旋家族中的一种核转录因子，在多种人类细胞中广泛表达 [6] [7] 。非活性状态下，AhR与分子伴侣结合于细胞质中。AhR与配体结合后，与分子伴侣分离并与AhR核转录子(AhR Nuclear Translocator, ARNT)结合，并从细胞质转移至细胞核中激活下游目的基因序列的表达 [8] [9] 。AhR可以通过激活蛋白激酶C (PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，参与多种细胞信号通路的调节，在调控细胞增殖分化、凋亡、炎症反应等多种重要生物学过程中发挥作用 [10] [11] [12] 。6-甲酰基吲哚并[3,2-B]咔(FICZ)是AhR的一种内源性高亲和力配体，通过与AhR结合起活化作用 [13] ，而1-甲基-氮-[2-甲基-4-[2-(2-甲基苯基)二氮烯基]苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺(CH223191)是AhR的有效特异性拮抗剂，抑制AhR的活化。近年来研究发现，在人气道上皮细胞中，AhR在被激活后可诱导MUC5AC过表达 [14] ，但AhR在干眼中对黏蛋白MUC5AC的调控作用鲜少研究。
本研究将通过皮下注射氢溴酸东莨菪碱溶液联合模拟干燥环境建立动物模型及结膜杯状细胞模型，研究AhR在干眼中对结膜杯状细胞及黏蛋白MUC5AC的调控作用。
2. 实验材料
2.1. 实验对象
2.1.1. 实验动物
体重约为20 g的7周至8周龄健康C57BL/6雌性小鼠(济南鹏悦实验动物繁育有限公司)。
2.1.2. 小鼠结膜杯状细胞
利用组织块培养法从小鼠结膜组织中提取，具体方法见下文(2.3.4小鼠结膜杯状细胞体外原代培养、2.3.5小鼠结膜杯状细胞的纯化和传代培养)。
2.2. 试剂和耗材
2.2.1. 干眼模型的建立
东莨菪碱氢溴酸盐 上海麦克林生化科技有限公司，生理盐水溶液(0.9%) 青岛大学附属医院。
2.2.2. 小鼠结膜杯状细胞的提取及培养
MEM-ALPHA培养基 美国Hyclone公司，胎牛血清 美国Hyclone公司，青霉素–链霉素溶液 北京Solarbio公司，L-谷氨酰胺 美国Sigma公司，HEPES液 美国Sigma公司，PBS缓冲液 北京Solarbio公司，0.125% Trypsin-EDTA 美国Gibco公司。
2.2.3. 动物和细胞实验预处理
6-甲酰基吲哚并[3,2-B]咔(FICZ) 美国Sigma公司，1-甲基-氮-[2-甲基-4-[2-(2-甲基苯基)二氮烯基]苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺(CH223191) 美国AbMole公司。
2.2.4. RT-PCR
RNA裂解液 大连TaKaRa公司，异丙醇分析纯 江苏强盛功能化学股份有限公司，逆转录试剂盒 南京挪威赞公司，氯仿分析纯 江苏强盛功能化学股份有限公司，SYBR 大连TaKaRa公司，DEPC水 上海生物工程有限公司，引物的设计与合成 大连TaKaRa公司。
2.3. 实验方法
2.3.1. 建立干眼小鼠模型
将C57BL/6雌性小鼠随机分为四组(CON组、干眼(DE)组、DE + FICZ组、DE + CH223191组)，模型组及处理组小鼠饲养于恒温(24℃ ± 2℃)、恒湿(30% ± 5%)、恒定风速(2.5 ± 0.5 km/s)的环境中，每天4次(10:00, 13:00, 16:00, 19:00)皮下注射0.3%氢溴酸东莨菪碱溶液0.2 mL，连续14天。CON组小鼠置于正常环境中饲养，每天相同时间皮下注射等量生理盐水。14天后采用酚红棉线法检测各组小鼠泪液分泌量，角膜荧光素钠染色检测各组小鼠眼表损伤情况。实验设计严格遵循实验动物使用的伦理准则，并获取伦理委员会批准。
2.3.2. 小鼠干眼临床评分
在干眼小鼠模型建立后第15天，对各组小鼠的眼表损伤程度进行评级划分，将角膜分为4个象限，每个象限单独计分，总分为4个象限评分之和(0~16分)，评分原则如表1 [15] 。
2.3.3. AhR激动剂FICZ、抑制剂CH223191对动物模型的处理
建模后DE + FICZ组小鼠球结膜下注射0.001% FICZ溶液0.1 mL，每天2次，DE + CH223191组小鼠球结膜下注射0.2% CH223191溶液0.1 mL，每天2次，连续给药1周。采用酚红棉线法检测各组小鼠泪液分泌量，角膜荧光素钠染色检测各组小鼠眼表损伤情况，引颈处死小鼠进行结膜收集。
2.3.4. 小鼠结膜杯状细胞体外原代培养
1) 引颈处死小鼠并使用75%乙醇消毒，立即无菌条件下切开皮肤，逐层分类结膜，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。
2) 超净工作台内，0.001%青霉素–链霉素溶液冲洗2~3次，浸泡30分钟，PBS缓冲液冲洗2~3次。
3) 放入培养皿，置于手术显微镜下无菌分离出较纯的结膜组织，剪成约1 mm3大小的组织块，均匀铺到24孔板中，每孔10块组织，放入5% CO2恒温培养箱中培养20分钟。
4) 加入MEM-ALPHA培养液(含20% FBS、2 mM谷氨酰胺、0.2 m MHEPES、10 μg/mL青霉素–链霉素溶液)至刚好没过孔板底部，放入5% CO2恒温培养箱中培养，24小时后换液并加培养液至没过所有组织块，每天观察细胞生长状况，每48小时换液1次。
2.3.5. 小鼠结膜杯状细胞的纯化和传代培养
1) 组织块边缘形成细胞环，去除组织块继续培养至细胞融合达孔板80%进行传代。
2) 弃去培养液，PBS缓冲液冲洗3次，0.125% Trypsin-EDTA消化3分钟，加入含20% FBS的MEM-ALPHA培养液终止消化。
3) 吹打分散细胞，1000 r/min离心10分钟收集细胞，弃去上清液，PBS缓冲液洗2次。加入MEM-ALPHA培养液重悬细胞混匀，显微镜下计数，按5 × 104个/mL，1:3传代至24孔板中培养。
2.3.6. 小鼠结膜杯状细胞的刺激与抑制实验
FICZ组加入FICZ (100 nM)处理12小时，CH223191组加入CH223191 (10 μM)处理12小时，收取细胞进行RT-PCR实验。
2.3.7. RT-PCR实验方法
1) 总RNA的提取
收集小鼠结膜组织、结膜杯状细胞于RNA裂解液中裂解30分钟，4℃，12,000 rpm转速条件下离心5分钟，吸取上清液移入新的EP管中。向上清液中加入120 μL三氯甲烷，混匀后在室温条件下静置5分钟，待分层后再次在4℃，12,000 rpm转速条件下离心5分钟。随后可见样本分为三层，吸取上层RNA移入新的EP管中。加入相同体积的异丙醇，充分混匀后再次在室温条件下静置10分钟。4℃，12,000 rpm转速条件下离心10分钟。弃去上清液，沿管壁缓慢加入500 mL 75%的乙醇(无水乙醇:DEPC水 = 3:1)，充分混匀后在4℃，12,000 rpm转速条件下离心5分钟。在室温条件下静置20分钟待乙醇挥发。加入适量DEPC水溶解RNA，可置于−80℃冰箱储存备用。
2) RNA浓度检测
吸1 μl RNA，使用核酸蛋白分析仪检测所有样本在260 nm/280nm处的OD值(吸光度值)及A260/280的比值。根据测得的RNA浓度计算2 μg RNA的样本溶液体积。
3) 逆转录反应
逆转录反应按照逆转录试剂盒说明书进行。
4) PCR反应
设置PCR反应条件，重复40个循环，循环结束后记录循环数阈值结果。引物序列见表2。
2.3.8. 统计学处理
各实验均独立操作，各组样本量n ≥ 6，至少重复操作三次。为了比较两组之间的差异，采用t检验来确定差异的显著性。数据以x ± s表示，采用Graphpad Prism 8.0软件，对各组结果进行统计学分析，以P < 0.05为标准，差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. AhR活化对干眼的影响
首先，我们建立了CON组、干眼(DE)组、DE + FICZ组、DE + CH223191组小鼠模型，用酚红棉线法检测各组小鼠泪液分泌量，在裂隙灯钴蓝光下观察各组小鼠角膜荧光素钠染色情况。结果发现，DE组泪液分泌量明显减少，角膜荧光素钠着色明显，眼表损伤显著。与DE组相比，DE + FICZ组的泪液分泌量增多，临床评分减低，角膜损伤减轻，DE + CH223191组的泪液分泌量更少，临床评分更高，角膜损伤更严重(图1(a)，图1(b)，图1(c)，*P < 0.05；****P < 0.0001)，CON组的角膜没有明显损伤。
注：(a)：小鼠泪液分泌量。(b)：小鼠角膜荧光素钠染色代表图像。(c)：小鼠角膜荧光素钠染色评分。CON组、干眼(DE)组、DE + FICZ组、DE + CH223191组的小鼠泪液分泌量、角膜荧光素钠染色代表图像及临床评分。
Figure 1. AhR effect the progression and clinical score of dry eye
图 1.AhR对小鼠干眼进展及临床评分的影响
3.2. AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜组织中的表达
为了明确AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜组织中的表达，我们建立干眼小鼠模型，并对各组进行相应处理，收集结膜组织进行研究。结果显示与CON组相比，DE组AHR mRNA表达水平降低，与DE组比，DE + FICZ组表达水平升高，DE + CH223191组表达水平降低(图2(a)，**P < 0.01；****P < 0.0001)。MUC5AC在DE组的mRNA表达降低，在DE + FICZ组的表达水平显著升高，在DE + CH223191组的表达水平最低(图2(b)，*P < 0.05；****P < 0.0001)。DE组小鼠结膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的产生增加，给予AhR激动剂FICZ后，它们的水平降低，而给予AhR抑制剂CH223191后，它们的水平升高(图2(c)，图2(d)，图2(e)，图2(f)，*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001)。
3.3. AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜杯状细胞中的表达
为研究AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜杯状细胞中的表达，提取小鼠结膜杯状细胞，设立CON组、FICZ组、CH223191组。FICZ组给予FICZ (100 nM)刺激12小时，CH223191组给予CH223191 (10 μM) 处理12小时，RT-PCR结果表明，AhR、MUC5AC在FICZ刺激结膜杯状细胞后表达上调，而应用CH223191处理结膜杯状细胞后，AhR、MUC5AC mRNA表达下调(图3(a)，图3(b)，****P < 0.0001)。而炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在FICZ刺激结膜杯状细胞后表达下调，在CH223191处理结膜杯状细胞后表达上调(图3(c)，图3(d)，图3(e)，图3(f)，****P < 0.0001)。
4. 讨论
干眼是由泪液分泌不足、蒸发过多或泪液中成分异常导致的疾病 [16] ，且随年龄增长患病率不断上升，严重者会导致角膜并发症，甚至失明等 [17] 。目前针对干眼的治疗方式主要为人工泪液和抗炎治疗，有研究表明环孢素A (CsA)及部分人工泪液的使用会导致眼部烧灼感，甚至出现严重的炎性反应，加重干眼的发展 [18] [19] [20] 。已有研究证实，AhR在大鼠和人的角膜等多种眼部结构中表达，在眼睛的发育及多种
注：CON组、DE组、DE + FICZ组、DE + CH223191组AhR、MUC5AC及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达。
Figure 2. Expressions of AhR, MUC5AC and inflammatory factors in conjunctiva of mice
图2. AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜中的表达
注：CON组、FICZ组、CH223191组在小鼠结膜杯状细胞中AhR、MUC5AC及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达。
Figure 3. Expressions of AhR, MUC5AC and inflammatory factors in conjunctival goblet cells of mice
图3. AhR、MUC5AC及炎症因子在小鼠结膜杯状细胞中的表达
眼部疾病中起重要作用 [21] [22] 。活化的AhR可促进杯状细胞的增殖分化 [23] ，增加MUC5AC的分泌，维持泪膜稳定，保护眼表屏障，在治疗干眼中发挥重要作用。
为了明确干眼中结膜杯状细胞的变化及AhR在其中发挥的作用，本实验建立了小鼠干眼模型及结膜杯状细胞模型进行一系列研究。在体内实验中，我们发现AhR在干眼小鼠结膜组织中表达降低。干眼小鼠泪液分泌减少，眼表损伤加重，给予AhR激动剂FICZ后，损伤程度减轻，干眼临床评分降低，相反，给予AhR抑制剂CH223191后，眼表损伤进一步加重，临床评分显著升高。分别给予FICZ、CH223191处理后，MUC5AC的表达趋势与AhR的表达表达趋势一致，而干眼相关促炎因子的表达趋势相反，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在FICZ处理后表达降低，在CH223191处理后表达升高。此外，我们建立了小鼠结膜杯状细胞的体外模型，通过RT-PCR证实AhR在结膜杯状细胞中表达，同体内实验研究结果，AhR及MUC5AC均在FICZ处理后表达升高，在CH223191处理后表达下降，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达趋势相反。
已有研究证实，在人结肠癌细胞中，AhR被激活后通过促进杯状细胞增殖分化，正向调控MUC5AC分泌来发挥作用 [24] 。与已有研究结果一致，AhR在结膜杯状细胞中表达，AhR活化后可以促进结膜杯状细胞增殖分化，增加黏蛋白MUC5AC的表达，并减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的产生，减轻炎症反应，延缓干眼进展。此外，有研究表明，AhR被FICZ激活后通过ERK通路促进肠道杯状细胞增殖分化，增加黏蛋白的表达，改善结肠炎症 [25] ，另有研究显示，p-ERK1/2参与调控杯状细胞增殖过程 [26] [27] 。在干眼中，AhR是否通过p-ERK1/2通路调控结膜杯状细胞的增殖分化及MUC5AC的分泌有待于进一步探讨。未来，AhR可能成为干眼治疗的新靶点。
参考文献
NOTES
*通讯作者Email: wangqian810@126.com