SARS-CoV-2入胞机制的研究进展

Research Progress on the Mechanism of SARS-CoV-2 Entry into Cells

摘要: 新冠病毒(SARS-CoV-2)大流行对全球的公共卫生及经济造成了前所未有的影响，有关它的研究也成为了当前科学界最热门的领域之一；作为病毒感染的首要环节，SARS-CoV-2的入胞机制更成为人们认识病毒行为、研究阻断病毒入侵途径的关注点。本文对SARS-CoV-2进入细胞过程中涉及的蛋白、受体、辅助因子、入胞过程中的S蛋白构象变化、入胞途径等进行了全面综述，以期展示SARS-CoV-2的入胞条件与动态图谱，为明晰病毒与细胞的相互作用、研制疫苗或治疗药物奠定基础。

Abstract: The novel coronavirus pandemic made great impact on both public health and economy, and thus became one of the major hotspots in research. As the primary step of infection, how SARS-CoV-2 viruses enter the host cells is the key to understand the viral behavior and also crucial for blocking the virus infection. To illustrate the cell entry process, the proteins, receptors, cofactors, conformational changes of S proteins and pathways involved in the entry process of SARS-CoV-2 into cells were comprehensively reviewed. The perspicuity on cellular entry conditions and viral dynamic change during this process helps to understand the virus-cell interaction and lays fundation for vaccines and therapeutic drugs development.

1. 概述

SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行，至今已感染超过6亿人并导致超660万人的死亡 (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)。该病毒一种是具有包膜的单股正链RNA病毒 [1] ；其基因组编码三类蛋白，分别是在病毒RNA合成中起作用的pp1a和pp1ab；在病毒的侵入和组装过程中必不可缺的结构蛋白，如刺突蛋白(S)，包膜蛋白(E)，膜蛋白(M)及核衣壳蛋白(N)；和涉及到病毒的致病性及免疫逃逸的另外9种附属蛋白 [2] 。由于SARS-CoV-2入胞过程是病毒复制周期中的第一步，亦是最重要的感染环节，因此，入胞过程成为了疫苗及药物设计的靶向之一 [3] - [10] 。本文主要针对该过程中涉及的病毒S蛋白与细胞表面受体的结合、蛋白的变构与活化、病毒膜与细胞膜的融合及内化等过程的研究进展进行综述。

2. S蛋白的结构与功能

SARS-CoV-2的S蛋白是三聚体跨膜糖蛋白，每个单体包含两个亚基，分别为S1亚基和S2亚基。S1亚基分N末端区域(NTD)和C末端区域(CTD)，其中CTD包含受体结合域(RBD) [11] (图1)；RBD可在“上开”与“下合”两种构象中变化，实现在结合受体和逃逸免疫之间的功能转换 [12] 。相比S1亚基，S2亚基包含多个功能域，包括融合肽(FP)、HR1与HR2、跨膜域(TM)、以及位于S2亚基C端细胞质尾部(CT)。S2亚基被蛋白酶切割后，由大部分疏水氨基酸组成的S2亚基构象改变可暴露出FP结构域，触发S2从融膜前状态转换成融膜状态，在膜融合过程中发挥穿透并锚定在细胞膜上的作用，继而牵拉病毒膜与细胞膜互相靠近，实现病毒膜与细胞膜的融合 [13] ；FP之后的HR1与HR2是由HPPHCPC组成的两个七肽重复域，这种氨基酸排列会形成疏水性的二级结构，并且通过构象的重折叠触发FP牵拉病毒膜与细胞膜的融合过程 [14] [15] 。HR2之后的跨膜域(TM)主要功能则是将S蛋白锚定在病毒膜上 [16] [17] 。另外，在S1/S2处存在一段多碱性氨基酸序列(即RRAR)，形成Furin酶切位点，可被Furin (弗林蛋白酶)裂解形成S1亚基和S2亚基 [18] 。

3. S蛋白的受体

3.1. 主要受体ACE2及受体辅助因子

在COVID-19爆发的早期，科学家已研究证实SARS-CoV-2与SARS-CoV均使用细胞表面的血管紧张转换素酶2 (ACE2)作为主要受体进入细胞 [11] [12] 。虽然两者的RBD序列仅有74%的一致性，但由于某些关键氨基酸的替换，致使SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2的亲和力相比SARS-CoV高10~20倍 [19] ，这一特性使SARS-CoV-2可以在人群中进行高效传播。研究显示猴，兔子，穿山甲，蝙蝠，猫，狗等动物的ACE2也可以与SARS-CoV-2的RBD结合，虽然结合效率不尽相同，但提示着SARS-CoV-2也可能是从天然宿主跨物种传播至这些动物中并进行适应后再传播至人的进化过程 [20] [21] 。

此外，研究人员发现NPR(神经纤毛蛋白)和CD4等可作为ACE2的受体辅助蛋白 [22] [23] ，通过协助ACE2与S蛋白的结合，显著提高SARS-CoV-2的感染率。其中NPR是一类非酪氨酸激酶跨膜蛋白，NPR1和NPR2能特异识别并结合Furin切割S1/S2位点后形成的C末端R/K-X-X-R残基。研究发现，对NPR1活性的抑制可降低SARS-CoV-2对CaCo-2细胞的感染率 [24] [25] 。而CD4可直接结合SARS-CoV-2的RBD，协助病毒以依赖于ACE2/TMPRSS2通路进入CD4+T淋巴细胞(如辅助性T细胞)中 [26] 。因此，NPR和CD4等作为受体辅助因子，可能在SARS-CoV-2对某些低水平表达ACE2细胞的感染中发挥补偿作用。

注：SP：信号肽；NTD：N末端区域；RBD：受体结合域；RBM：受体结合基序CTD1：C末端区域1；CTD2：C末端区域2；FP：融合肽；HR1：七肽重复域1；HR2：七肽重复域2；TM：跨膜域；CT：胞质尾部；S1/S2：S1/S2切割位点；S2’：S2’切割位点；FCS (红色)：弗林酶切割位点；SARS-CoV-2：新冠病毒；RaTG13：中华菊头蝠冠状病毒；SARS-CoV：SARS病毒；Pangolin CoV MP798：穿山甲冠状病毒；Bat SL-CoV ZXC21；蝙蝠SARS样冠状病毒。

Figure 1. The structure of S protein

图1. S蛋白结构域示意图

3.2. 潜在受体

研究表明SARS-CoV-2还可以利用细胞表面的其他蛋白作为潜在受体或辅助受体。其中AXL (酪氨酸蛋白激酶受体)可作为SARS-CoV-2进入呼吸系统的潜在受体，敲除AXL后能显著减少SARS-CoV-2对人肺细胞的感染 [27] ；CD147的人工表达也可实现SARS-CoV-2对BHK21的有效感染 [28] 。卢智刚团队从5046种人类膜蛋白中筛选出12种能与SARS-CoV-2的S蛋白互作的膜蛋白，其中的ASGR1 (去唾液酸糖蛋白受体1)和KREMEN1 (含环状结构的跨膜蛋白1)经实验证实能与S蛋白结合并促使病毒感染低水平表达ACE2的免疫细胞群 [29] 。SARS-CoV-2多受体结合的特征，提示其具有更大的细胞侵袭性，与临床上观察到的部分COVID-19病人出现系统性多器官感染的症状相符。

此外，LFA-1可与SARS-CoV的跨膜蛋白ORF7a直接结合，可能是SARS-CoV感染白细胞时的黏附因子或受体 [30] 。最新研究发现，在感染Jurkat-ACE2-KO (敲除ACE2的人急性淋巴细胞白血病细胞)时，LFA-1 (白细胞相关因子受体1)可能成为SARS-CoV-2主要的受体 [31] ，提示SARS-CoV-2在感染淋巴细胞时可采用不依赖于ACE2/TMPRSS2的方式，但其具体机制如何仍待进一步研究证实。

4. SARS-CoV-2进入细胞的条件

SARS-CoV-2入胞过程中S蛋白需要进行一系列的构象改变，为病毒膜与细胞膜相互靠近融合过程提供所需的能量。这种构象的改变靠S蛋白与ACE2结合后经历的两次蛋白酶的切割来实现。第一次是Furin切割S1/S2分界处由多碱性氨基酸位点(RRAR)组成的弗林酶切位点(FCS) [18] ，第二次是细胞蛋白酶如TMPRSS2或Cathepsin L裂解S2亚基中FP前的S2’位点 [32] 。除此之外，研究发现trypsin (胰酶)、Elastase (弹力蛋白酶)及Plasmin (血纤维蛋白溶酶)等蛋白酶也能S蛋白水解激活的过程中起到一定的作用 [33] [34] 。不同的蛋白酶将决定病毒入胞的不同途径(详见6. SARS-CoV-2进入细胞的途径)。

5. S蛋白介导膜融合的机制与过程

SARS-CoV-2的膜融合是在S蛋白与受体结合之后，由S蛋白经过高能量构象变化以触发病毒膜与细胞膜进行融合的过程 [35] 。在SARS-CoV-2的S蛋白结构研究中，人们发现了影响膜融合过程的几个关键元素，分别是融膜肽末端区域(FPPR)，RBD区域的630 loop以及S1-CTD2 (见图1)，主要参与调节S蛋白融膜肽构象的改变 [23] 。在S蛋白三聚体结构中，FPPR和630 loop维持RBD处于非活性的状态。当相邻的RBD构象改变，处于活性状态并与ACE2结合时，将促使FPPR和630 loop构象也发生改变；其中FPPR构象改变可使S2’位点得以暴露，便于蛋白酶识别与切割；而630 loop构象改变后则暴露出S1-CTD2疏水区域，影响S1与S2亚基的结合，最终导致S1亚基的脱离；在S1亚基脱离后，S2亚基发生了一系列构象重折叠过程，促使S2亚基构象从亚融合稳定状态过渡到稳定融合状态 [36] 。S2亚基的HR1构象展开后，驱动融合肽插入进靶细胞膜中，随后HR2再折叠进行构象改变，并牵拉的病毒膜与细胞膜拉向同一侧，这种过程导致相互作用的膜弯曲并逐渐靠近彼此，最终触发膜融合过程(如图2)；膜融合过程并非自发进行，需要消耗高能量去实现膜相互靠近的过程，所需能量则由一系列的构象改变提供 [35] 。

注：ACE2：血管紧张素转换酶2；S：刺突蛋白；S1：S1亚基；FP：融合肽；HR1：七肽重复域1；HR2：七肽重复域2；TM：跨膜域；(1) 病毒吸附：SARS-CoV-2 S蛋白识别并结合细胞膜表面的ACE2受体；(2) 亚稳定融合状态：S蛋白经蛋白酶水解切割形成S1与S2亚基，S2亚基的HR1构象展开，驱动FP嵌入细胞膜中；(3) 重折叠状态：S2亚基的HR2发生折叠构象改变，牵拉病毒膜与细胞膜相互弯曲靠近；(4) 融膜后状态：病毒膜与细胞膜融合之后，实现病毒入胞。

Figure 2. The process of fusion of membrane

图2. 膜融合过程

6. SARS-CoV-2进入细胞的途径

目前研究发现SARS-CoV-2有两种进入细胞的方式，而采用哪种入胞方式主要取决于裂解S2’位点的蛋白酶 [9] 。若细胞表面存在TMPRSS2，病毒主要通过依赖Furin/TMPRSS2调控方式，实现质膜融合的过程进入细胞(图3，1→3途径) [37] ；但在TMPRSS2缺乏的细胞系中，SARS-CoV-2则依赖于网格蛋白调控内吞方式形成核内体结构，最终激活Cathepsin L识别并裂解S2’位点实现核内体膜融和过程(图3，1→2→3途径) [38] 。有研究表明，敲除Furin酶切位点的突变株对人肺细胞的感染效率相比野生型毒株降低10倍左右；感染突变株的金黄地鼠，不仅体重没有明显变化，还能有效保护金黄地鼠面对野生型毒株致死量的攻击 [39] [40] [41] ；在雪貂的传播实验中，突变株不仅在上呼吸道中不能进行高效复制，还无法通过空气传播感染相邻的雪貂 [42] 。综上所述，Furin酶切位点的存在可增强S蛋白的水解激活，并有利于提高SARS-CoV-2的Furin/TMPRSS2质膜融合效率，从而进一步增强了SARS-CoV-2的感染性、扩大了其感染向性范围 [37] [43] 。

注：1→3：质膜融合进入通路；1→2→3：核内体膜融合进入通路；4：蛋白合成；5：蛋白加工；6：RNA合成；7：病毒组装；8：病毒释放。

Figure 3. The pathways of SARS-CoV-2 entry cell

图3. SARS-CoV-2进入细胞的通路

7. 总结

相比SARS-CoV，由于SARS-CoV-2的S蛋白中有Furin酶切位点，病毒的感染性显著增强。尽管过去两年多的时间，新冠病毒一直在突变进化，但该位点却一直保留，成为病毒维持其流行能力的一大特征。虽然ACE2作为SARS-CoV-2主要的受体分子，但在最新的研究中发现，还有一些细胞蛋白可以作为其的潜在受体或ACE2辅助因子，弥补了在某些低水平表达ACE2受体的组织/细胞的感染，扩大了SARS-CoV-2组织向性的范围。此外，SARS-CoV-2能结合不同种属ACE2可为其溯源过程提供一定的参考依据。

SARS-CoV-2的整个入胞过程是由多种分子共同参与的一个复杂过程，既包括Furin/TMPRSS2途径，又存在Cathepsin旁路。针对这一特性，使用蛋白酶抑制剂的鸡尾酒疗法能取得不错的治疗效果，临床实验表明，同时使用甲磺酸卡莫司他(TMPRSS2抑制剂)及E64d (Cathepsin L抑制剂)时能完全抑制SARS-CoV-2的感染 [9] [44] 。

本文主要对SARS-CoV-2入胞机制的研究进展进行总结，尤其是S蛋白的水解激活过程，以及介绍了SARS-CoV-2在低水平表达ACE2的细胞/组织所结合的潜在受体或受体辅助因子，为全面理解和认识SARS-CoV-2的入胞机制提供重要的依据。尽管SARS-CoV-2的入胞机制研究已经取得显著的进展，但仍有一些未解的问题，如与S蛋白NTD结合的AXL是如何诱导膜融合过程？在受体结合过程中，需要多少三聚体S蛋白与ACE2结合后才触发膜融合过程？SARS-CoV-2感染过程中，不同种属的ACE2与三聚体S蛋白的结合方式是一致的？待更多未解的问题被研究清楚后才能针对SARS-CoV-2的入胞机制研制出广谱的疫苗或抑制剂有效干预COVID-19的流行。

基金项目

广东省科技专项资金“基于大数据分析的病原诊断和防治”(2019ST042)；广东省科技专项资金“病毒性新发传染病的研究与防治”(210804126870918)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。