摘要: 目的：探讨良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia, BPH)与勃起功能障碍(Erectile dysfunction, ED)的因果关系。方法：使用公开的BPH及ED全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)汇总数据集分别作为暴露因素及结局变量，运用逆方差加权法、简单模式法、加权中值法、加权模式法及MR-Egger法进行两样本孟德尔随机化(Two-sample Mendelian randomization, TSMR)分析。结果：经筛选确定23个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)作为工具变量，逆方差加权法支持前列腺增生与勃起功能障碍的因果关系(OR and 95% CI: 1.130, 1.014~1.259; p = 0.026)。简单模式法(Simple mode)也显示出相同的因果关系(OR and 95% CI: 1.370, 1.033~1.819; p = 0.040)。MR-Egger：(OR and 95% CI: 1.276, 0.836~1.946; p = 0.271)；加权中位数法：(OR and 95% CI: 1.151, 0.979~1.354; p = 0.090)；加权模式法：(OR and 95% CI: 1.267, 0.989~1.622; p = 0.074)。工具变量之间可认为不存在异质性与水平多效性；使用“留一法”(leave-one-out)进行敏感性分析，因果效应稳健。结论：孟德尔随机化分析结果支持BPH与ED风险增加存在因果关系，为ED的预防和治疗提供了新思路。
Abstract:
Objective: To explore the causal relationship between benign prostatic hyperplasia (BPH) and the risk of erectile dysfunction (ED). Methods: The published genome-wide association studies-wide as-sociation study (GWAS) BPH and ED data set were used as the exposure factor andoutcome varia-bles, respectively. Two-sample Mendelian randomization (TSMR) analysis was performed using in-verse variance weighted, simple mode, weighted median, weighted mode methods and MR-Egger regression. Results: Twenty-three SNPs were selected as the instrumental variables, and the in-verse variance weighted method supported the causal relationship between BPH and risk of ED (OR and 95% CI: 1.130, 1.014~1.259; p = 0.026). Simple mode also showed the same causal association (OR and 95% CI: 1.370, 1.033~1.819; p = 0.040). MR-Egger: (OR and 95% CI: 1.276, 0.836~1.946; p = 0.271); Weighted median: (OR and 95% CI: 1.151, 0.979~1.354; p = 0.090); Weighted mode: (OR and 95% CI: 1.267, 0.989~1.622; p = 0.074). It could be considered that there was no heterogeneity and horizontal pleiotropic effect between instrumental variables. The causal effect was robust using the “Leave-one-out” method for sensitivity analysis. Conclusion: Two-sample Mendelian randomiza-tion supports the causal relationship between BPH and increased risk of ED, which provides a new idea for the prevention and treatment of ED.
1. 引言
良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia, BPH)是男性老年人较为常见的一种良性疾病，在大于50岁男性中的发病率超过50%，也是引起下尿路症状(Lower urinary Tract symptoms, LUTS)的主要疾病之一 [1]。随着我国人口老龄化程度的进展，良性前列腺增生以及其引起的LUTS及其他合并疾病大发生率将进一步增加 [2]。无法产生或维持足够的阴茎勃起以满足性表现为勃起功能障碍(Erectiledys function, ED)，这是一种传统的男性功能障碍，在全球范围内随着男性年龄增长而增加 [3]。ED是一种成因多维且较为常见的男性功能障碍，在过去ED曾被认为是一种心理障碍，但最近的证据表明，超过80%的病例存在有器质性成因 [4]。过去的研究表明，ED在老年男性中的发病较为普遍，马萨诸塞州男性衰老研究(Massachusetts Male Aging Study, MMAS)显示，在40~70岁的男性中，轻度至中度勃起功能障碍的综合患病率为52% [5]。
过去的流行病学研究数据表明：患有BPH的男性与ED的发生之间可能存在关联 [6] [7]。然而传统临床研究中鲜有研究者明确BPH与ED之间的相互联系，而基于以上流行病学研究结果以及BPH和ED的发生在老年患者中均较高的特点，我们尝试使用孟德尔随机化的方法确定这两种疾病之间可能的关系。
孟德尔随机化法(Mendelian randomization, MR)是一种利用单核苷酸多态性(nucleotide polymorphisms, SNP)作为工具变量去研究暴露或危险因素与临床结局之间关联的因果关系的分析方法 [8]。孟德尔随机化依靠随机化进行因果推论，也被称作“自然随机对照试验”，当随机分配的遗传工具引起的暴露与研究结局相关，那么观察到的暴露与结局之间的关联可解释为因果关系 [9]。因此本研究旨在使用孟德尔随机化法探究BPH与ED之间的因果关系。
2. 资料与方法
2.1. 资料来源
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)作为工具变量，BPH作为暴露因素，ED为结局变量。BPH来自芬兰数据库(https://www.finngen.fi/en/access_results)，包括22091例病例和100050例具有欧洲血统的对照组。ED数据来源于目前关于ED最广泛的数据库全基因组关联研究(GWAS) [10]。这项研究在223,805名欧洲男性中的6175名ED患者中进行，所采用的ED的诊断是自我报告的或医生诊断的(ICD10代码：N48.4和F52.2)。因性功能障碍而口服ED药物(伐地那非/艾力达、他达拉非/西力士或西地那非/伟哥)或接受ED手术(OPCS-4代码：L97.1和N32.6)的男性也被包含在内。
2.2. 工具变量的筛选
我们从选定的GWAS数据库里提取适合孟德尔随机化的工具变量。为了避免连锁不平衡偏倚，我们剔除效应等位基因 < 0.01的SNP，在数据库里选择与暴露(良性前列腺增生)强关联的SNP (p < 5 × 10−8)，与前列腺增生相关的显著SNP的LD须满足以下条件：r2 < 0.001、遗传距离为10,000 kb。我们在TwoSampleMR R包中删除了等位基因频率接近0.5的回文SNP，因为这些回文SNP (例如，它们的等位基因是A/T或G/C)将引入潜在的链翻转问题，并导致暴露数据集和结果数据集之间效应等位基因协调的模糊性 [11]。我们确保暴露和结果数据集中的工具变量是一致的，都来自同一方向的DNA链。为了评估纳入的SNPs是否受到了弱工具变量的影响，我们计算单个SNP [12] 的方差解释比例(PVE)，然后计算F统计值 [13] 来评估这个问题。若该SNPＦ统计量 < 10，说明该SNP存在弱工具变量偏倚的可能性，进而将其剔除，避免对结果造成影响 [14]。最后从23个选定的SNP中，记录效应等位基因(effect allele, EA)、其他等位基因(other allele, OA)、等位基因效应大小(β)、标准误(SE)、p值及F值信息(见表1)。
Table 1. Basic information on SNPs associated with benign prostatic hyperplasia and erectile dysfunction
表1. 与前列腺增生与勃起功能障碍相关的工具变量的基本信息
2.3. MR分析
为更好的估计因果效应，MR分析中SNP做为IV应满足3个关键假设 [15]：① 选定的IV须与暴露因素紧密相关；② IV应独立于混杂因素；③ IV只能通过暴露因素影响结局，不通过其他途径。采用R (4.0.2版本)中的“TwoSampleMR”进行分析，p < 0.05认为差异有统计学意义。使用5种MR分析方法(逆方差加权法、简单模式法、加权中位数法、加权模式法及MR-Egger法)分析前列腺增生与勃起功能障碍间是否存在因果关系。其中逆方差加权法(IVW)、简单模式法、加权中位数法及加权模式法主要用于MR分析。MR-Egger截距检验主要用于潜在多效性效应的统计检验。采用随机效应的IVW分析方法对前列腺增生和勃起功能障碍的SNPs相关性进行回归分析，计算IV比值估计的方差加权平均值的反比。由于随机效应的IVW允许每个SNPs产生不同的平均效应，我们采用随机效应的IVW方法 [16]。为确保选择的IV不会通过除前列腺增生以外的生物途径影响勃起功能障碍风险的这一结局变量，采用MR-Egger截距检测评估IV与其他潜在混杂因素间的多效性关系 [17]。这种回归方法的斜率代表了因果效应的评估，截距代表遗传变异的平均水平多效性效应的评估 [18]。
2.4. 异质性和敏感性分析
采用Cochran的Q检验和漏斗图评估SNPs间的异质性 [19] [20]。为了评估未知的多效性，我们采用了多种分析方法：1) 敏感性分析 使用了“leave-one-out”探讨单个SNPs驱动这种因果关联的可能性；2) MR-Egger截距检验评估基因变异与其他潜在混杂因素的多效性关联。3) MRPRESSO评估是否存在离群值。在排除已知的多效性SNPs后我们重复上述的孟德尔随机分析。
3. 结果
3.1. SNPs基本信息
在全基因组水平上能有效预测前列腺增生的1317个SNPs可以用作潜在的IV。通过设立连锁不平衡条件：r2 < 0.001、遗传距离为10,000 kb，与结局变量勃起功能障碍匹配，共有28个SNP满足条件，排除回文SNP：rs10788167，rs1606303，rs17101982，rs3213180，rs35908689。最终经筛选确定23个个与良性前列腺增生与勃起功能障碍均存在关联的具有全基因组意义(p < 5 × 10−8)的SNPs作为IV，这些SNP共代表了0.803%的BPH的变化。总F值为42.960，每个SNP的F均>29，说明该研究不受到弱工具变量的影响，详见表1。
3.2. TSMR分析
IVW方法结果显示前列腺增生与勃起功能障碍存在显著的因果关系(OR and 95% CI: 1.130, 1.014~1.259; p = 0.026)；Simple mode与之结果接近(OR and 95% CI: 1.370, 1.033~1.819; p = 0.040)；MR-Egger：(OR and 95% CI: 1.276, 0.836~1.946; p = 0.271)；加权中位数法：(OR and 95% CI: 1.151, 0.979~1.354; p = 0.090)；Weighted mode：(OR and 95% CI: 1.267, 0.989~1.622; p = 0.074)。IVW方法作为我们研究的主分析，表明前列腺增生与勃起功能障碍风险增加存在因果关系。MR-Egger分析显示结果中的定向多效效应不太可能导致偏倚(截距 = −0.011，P = 0.567)。详见表2、图1(a)、图1(b)。
Table 2. MR analyses to assess the causal effect of benign prostatic hyperplasia on erectile dysfunction
表2. 评估前列腺增生对勃起功能障碍的因果影响的MR分析方法
Figure 1. Results of two-sample Mendelian randomization of benign prostatic hyperplasia and erectile dysfunction. (a) Scatter diagram; (b) Forest plot; (c) Funnel plot; (d) Sensitivity analysis
图1. 前列腺增生与勃起功能障碍的两样本孟德尔随机化结果。(a)为散点图；(b)为森林图；(c)为漏斗图；(d)为敏感性分析
3.3. 异质性检验和敏感性分析
使用Cochran’s Q检验和漏斗图来检验IV间的异质性。MRPRESSO显示不存在离群值(p = 0.068)。MR-Egger回归法结果为Cochran’s Q = 20.265，p = 0.505；IVW结果为Cochran’s Q = 20.604，p = 0.545，可认为IV间不存在异质性。MR-Egger回归的截距可以作为一个指标，表明IV的水平多效性是否影响了MR分析的结果。截距接近0，p > 0.05 (Egger_intercept = −0.011，p = 0.567)，表明IV不存在水平多效性，影响MR分析结果的可能性不大。漏斗图表明，单个SNP作为IV产生的因果相关的点，基本呈对称分布，表明IV之间差异小，见图1(c)。敏感性分析使用“留一法”(leave-one-out, LOO)逐个去除SNP，剩余 SNPs的因果效应与全部SNPs的MR分析结果比较，以确定因果关联是否由单个IV导致，MR分析结果稳健，见图1(d)。
4. 讨论
由于缺乏严格对照的临床试验和纵向的前瞻性研究，BPH和ED之间的关联很难得到证实，而在孟德尔随机化的框架下，采用公开的GWAS数据集，运用TSMR分析，IVW方法结果(OR and 95% CI: 1.130, 1.014~1.258; p = 0.026)为BPH患者发生ED的风险更高这一因果关系提供了新证据。
尽管对于BPH可能引起ED发生的病理生理机制并没有被完全确定 [21]，但仍有研究者尝试从阴茎勃起的生理机制方面做出解释。已证明的是阴茎的松弛与否受取决于海绵体平滑肌的状态，当平滑肌收缩时，阴茎保持松弛状态，而这一过程受肾上腺素能受体控制 [22] [23]。
Chang S, Hypolite JA等人进行的动物研究中，患有膀胱出口梗阻的兔海绵体平滑肌收缩出现困难，这与β1-肾上腺素受体密度和激动剂亲和力增加有关，同时膀胱出口梗阻引起海绵体平滑肌收缩元件的分子变化，导致平滑肌对肾上腺素激动剂响应产生的收缩力量增加，这些均可能导致了BPH男性的勃起功能障碍 [24]。另外，BPH和ED之间关系也可以用包括一氧化氮(NO)或氮能神经元缺乏、心理因素和涉及泌尿海绵体平滑肌张力分子调节剂等生物学方面的病理生理学进行解释 [25] [26]。同样，一项关于良性前列腺增生药物治疗与ED之间关联的研究表明，良性前列腺增生与ED发生之间存在着显著的统计学关联 [27]。
为了进一步确定BPH和ED的因果关系，在本次研究中，我们使用了关于ED的最新的GWAS中的最广泛的数据集，这包括了超过220,000人的GWAS [10]。我们采用了5种不同的分析方法(逆方差加权法、加权中值法及MR-Egger法)进行MR分析，结果显示前列腺增生与勃起功能障碍存在显著的因果关系(OR and 95% CI: 1.130, 1.014~1.258; p = 0.026)。我们选取孟德尔这一相对新颖的研究方式，其具有以下可取的特点：1) 遗传变异测量准确，可以捕捉长期时间上的暴露效应，从而避免了测量误差而导致的估计偏差 [28]；2) 等位基因在形成受精卵时即被随机分离，这种基因层面上的分离与出生后的混杂因素无关，使结果不易受到后天的潜在混杂因素和反向因果关系的影响 [29]。从这几方面上说，孟德尔随机化做到了模拟随机对照试验(Randomized controlled trial, RCT)来评估因果关系，以此得出的结论可为进一步临床或基础研究提供有力的遗传学依据。
由于过去关于ED与BPH的研究缺乏关键的直接证据，而孟德尔随机化由于其对于因果关系证明的独特优势，从遗传学的角度得出了BPH作为ED的危险因素的关键结论。这对于泌尿外科医生来说，无疑是具有临床意义的。在BPH患者的诊治过程中，依据研究的结论，泌尿外科医生可能会加强对患者的心理预防建设，并给予相应预防指导。同时对于ED的临床治疗，也提供了新的思路，也有助于下一步对于ED的基础及临床药物研究发展开辟了新的方向和道路。
诚然，本次研究也存在一定的局限性，首先，研究中采用的GWAS数据均来自于欧洲人群，需要更多的研究确认我们的研究结论是否适用于其他种族群体。其次，我们仅评估了BPH对于ED的影响，对于BPH引起的其他并发症(例如膀胱过度活动综合征、尿潴留等)也应在未来的研究中进行评估。最后，虽然MR能够评估BPH和ED的直接因果效应，但它可能无法准确评估这种效应被效度的大小，这可能会限制对医疗决策的影响及对临床结果的干预。
5. 结论
我们采用两样本孟德尔随机化的方法进行验证，研究结果显示良性前列腺增生与勃起功能障碍风险增加存在因果关系，这为未来的勃起功能障碍的预防和治疗提供了新的治疗思路。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者Email: jiaowei3929@163.com