1. 引言
前列腺癌(prostate cancer，PCa或prostate adenocarcinoma，PRAD)是全球男性中最常见的上皮性恶性肿瘤，也是男性癌症死亡的第二大常见原因 [1]。在中国，由于人口快速老龄化及生活方式的改变，PCa的发病率逐年增加 [2]。目前，前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)广泛用作PCa早期诊断的生物标志物，但其结果可能存在争议 [3]。PCa的发病机制非常复杂，具体的发病机理尚不明确。LIX1是一种在肢体发育期间表达的基因，通过调节Hippo效应子YAP1参与胃间充质祖细胞的增殖和分化 [4]。LIX1过表达可促进HCC的增殖、迁移和侵袭 [5]。LIX1在PCa中的表达及临床意义目前仍不明确。
本研究利用生物信息学方法，系统分析LIX1在PCa组织中的表达及其与PCa患者临床病理特征、预后和免疫浸润的关系，探讨LIX1在PCa中的临床意义，为PCa的早期诊断和治疗提供新思路。
2. 材料和方法
2.1. Oncomine分析
Oncomine (https://www.oncomine.org https://www.oncomine.org/ )数据库是癌症相关基因芯片数据库和集成数据挖掘平台，收集了最完整的癌症突变谱、相关基因表达谱和相关临床信息，可用于发现新的生物标志物或治疗靶点 [6]。本研究利用Oncomine分析不同PCa数据集中LIX1的mRNA表达水平。
2.2. UALCAN分析
UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一个易于使用的交互式门户网站，可分析肿瘤和正常样本以及基于个体癌症阶段、肿瘤等级、种族、体重的各种肿瘤亚组中查询基因的相对表达或其他临床病理学特征 [7]。本研究中选择使用UALCAN平台分析LIX1在PCa和正常组织中的表达情况，以验证Oncomine数据库的结果。
2.3. LIX1的诊断性能分析
从TCGA数据共享门户网站GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/)下载TCGA-PRAD项目中level 3 HTSeq-FPKM格式的RNA-seq数据和临床数据，将表达谱数据转换成TPM (transcripts per million read)格式并进行log2转化。绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve，ROC曲线)，分析LIX1对PCa诊断的意义，利用R3.3.3绘制ROC曲线，通过计算受试者工作特征曲线下面积(area under receiver-operating characteristic curve, AUC)，评估LIX1在PCa预测模型中的总体预测性能。
2.4. LIX1与PCa患者的临床病理特征分析
利用TCGA-PRAD队列中PCa患者的基因表达数据和临床信息，根据LIX1表达的中位值(0.4624)，将表达数据分为LIX1高、低表达两组，绘制临床基线表，分析LIX1表达水平与PCa患者临床病理特征之间的关系。
2.5. 预后分析
GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是一种交互式在线应用程序，包含了来自TCGA和GTEx数据库中的9736例肿瘤和8587例正常样本 [8]。我们利用GEPIA工具分析LIX1表达水平与PCa患者无病生存率(Disease Free Survival, DFS)和总生存率(overall survival, OS)的关系。CANCERTOOL (http://web.bioinformatics.cicbiogune.es/CANCERTOOL)是一个基于Web的界面，可提供快速、全面的基因表达数据的可视化分析 [9]。为此我们进一步利用CANCERTOO分析LIX1表达水平与PCa患者复发的相关性。
2.6. TIMER数据库分析
TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，一个在线数据库，可分析基因表达与肿瘤浸润免疫细胞(B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)水平之间的相关性 [10]。本研究利用TIMER数据探究LIX1基因表达与6种免疫细胞之间的关系，并进一步评估PCa中LIX1拷贝数变异与免疫细胞之间的关系。
2.7. LIX1共表达基因和基因组富集分析
LinkedOmics (https://www.linkedomics.org)是一个公开的门户网站，包含来TCGA项目的32种癌症类型和总共11,158名患者的多组学数据和临床数据 [11]。我们使用LinkedOmics筛选TCGA-PRAD队列中与LIX1共表达的基因，并利用LinkFinder模块对于这些基因进行GO_BP注释和KEGG分析。
2.8. 统计分析方法
使用配对样本t检验分析LIX1在PCa及其对应的癌旁前列腺组织中的表达差异。采用卡方检验及Fisher精确检验法绘制LIX1 ROC曲线和临床基线表。使用对数秩检验进行预后分析。Spearman相关性分析LIX1表达与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系。Pearson相关性检验筛选LIX1共表达基因。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. LIX1基因在PCa中的差异表达
利用Oncomine数据库比较LIX1在PCa队列中的表达差异，结果发现，与正常或良性前列腺组织相比，在Lapoine Prostate、Arredouani Prostate、Grasso Prostate、Tomlins Prostate、Vanajia Prostate和Taylor Prostate 3这6个独立的PCa队列中，LIX1的表达均显著降低(P < 0.05，图1(A)~(G))。UALCAN数据库的分析结果与Oncomine数据库的结果相似(P < 0.005，图1(H))。
3.2. LIX1的诊断价值应用
从ROC曲线可以看出，AUC值为0.844，95%CI在0.793到0.896之间，并且当最佳cut-off值为1.293时，其灵敏度和特异度分别为0.808和0.766 (图2)。以上表明LIX1在预测PCa组织和正常组织结局上具有较高的临床诊断价值。
Figure 2. The diagnostic value of LIX1 in differentiating normal tissue from PCa tissue
图2. LIX1在鉴别正常组织和PCa组织中的诊断价值
3.3. LIX1表达水平与PCa临床病理特征的相关性
临床基线表结果显示，LIX1表达水平降低与PCa患者临床特征显著相关，如表1和图3可见，LIX1表达水平与T分期显著相关，随着T分期增大而显著降低(P < 0.001，图3(A))。相比未发生淋巴结转移(N0)和未发生远端转移(M0)的PCa患者，发生淋巴结转移(N1)和发生远端转移(M1)的PCa患者的LIX1表达水平明显下调(P < 0.001，图3(B)、图3(C))。此外，格林森(Gleason)评分越高的PCa患者，LIX1表达水平越低(P < 0.001，图3(D))。LIX1表达水平与PCa患者年龄(Age)和PSA水平呈显著负相关(P < 0.001，图3(E)和图3(F))。
Table 1. Correlation between LIX1 expression and clinicopathological features in PCa patients
表1. LIX1表达与PCa患者临床病理特征的相关性
注：*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001；****：P < 0.0001。
Figure 3. Relationship between LIX1 expression level and clinicopathological features of PCa patients
图3. LIX1表达水平与PCa患者临床病理特征的关系
3.4. LIX1表达水平与PCa患者预后的关系
为了进一步明确LIX1表达与PCa患者临床结局之间的关系，CANCERTOOL分析结果表明，LIX1低表达的PCa患者复发风险更高(P < 0.05，图4(A))。我们利用GEPIA 数据库展开预后分析，结果显示，LIX1低表达组患者的DFS显著低于高表达组(Log-rank P < 0.05，图4(B))，而与总生存期(OS)无关(Log-rank P = 0.62，图4(C))。
Figure 4. Correlation between LIX1 expression level and survival prognosis of PCa
图4. LIX1表达水平与前列腺癌生存预后的相关性
3.5. LIX1与肿瘤免疫浸润的关系
TIMER数据库分析显示，LIX1的表达水平与PCa肿瘤纯度显著负相关(r = −0.438, P < 0.05)，与巨噬细胞(Macrophages)，(r = 0.176, P < 0.05)的浸润水平呈正相关，但与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞(Neutrophils)和树突状细胞(Dendritic cells, DC)的浸润水平无关(P > 0.05，图5(A))。进一步分析发现，LIX1基因的拷贝数变异与B细胞的浸润水平相关(P < 0.05，图5(B))。
Figure 5. Correlation between LIX1 expression and immune cell infiltration in PCa tissues
图5. PCa组织中LIX1表达与免疫细胞浸润水平的相关性
3.6. LIX1在PCa中的潜在作用机制
利用LinkedOmics网站进行分析发现，与LIX1表达呈正相关基因有5221个，负相关基因3358个(图6(A))，其中与LIX1正相关和负相关排名各前 50 的基因分别见(图6(B))和(图6(C))。对与LIX1共表达的基因进行GO_BP和KEGG富集分析，GO分析表明，这些基因主要富集在线粒体呼吸链复合物的组装(mitochondrial respiratory chain complex assembly)，胞质分裂(cytokinesis)和tRNA代谢过程(tRNA metaolic process) 等过程(图6(D)和表2)。
Table 2. GO BP analysis of LIX1 co-expression gene
表2. LIX1共表达基因GO_BP分析
KEGG富集分析显示，这些基于主要与氨酰基-tRNA的生物合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)，核糖体(Ribosome)和细胞周期途径(Cell cycle)等有关(图6(E)和表3)。
Figure 6. Analysis results of LIX1 related co-expression genes
图6. LIX1相关共表达基因分析结果
Table 3. KEGG analysis of LIX1 co-expression gene
表3. LIX1共表达基因KEGG分析
4. 讨论
PCa是男性最常见的癌症，目前用于PCa的治疗包括手术、放疗、化疗和激素治疗在内都会导致严重的副作用 [12]。因此，迫切需要寻找新的、可用于PCa早期诊断和早期预测临床结果的生物标志物。
本研究利用Oncomine和UALCAN数据库，对多个PCa数据集进行分析发现，LIX1在PCa组织中显著低表达，其表达水平与PCa患者的TNM分期、Gleason评分、年龄和PSA水平显著负相关，表明LIX1可能参与了PCa的发生和进展。目前认为，TNM分期和Gleason评分是PCa患者临床结局的重要参数和预测PCa预后最常用的指标 [13] [14] [15]。有研究指出，当Gleason评分 ≤ 6时，PCa患者死亡风险最小，随Gleason评分和年龄的增加，PCa的恶性程度和发病率显著增加 [16] [17]。我们通过绘制ROC曲线，发现LIX1的AUC值为0.844，说明其在区分PCa样本和非癌样本具有较高的准确性，这可能在PCa诊断的中起到重要的作用。此外，我们的结果表明LIX1与PCa的DFS显著相关，在LIX1低表达的PCa患者中的复发风险更高，提示LIX1的表达水平与PCa患者的临床结局密切相关。
此外，TIMER数据库分析结果表示，LIX1的表达与巨噬细胞具有显著相关性，另外，LIX1基因的拷贝数变异与B细胞的浸润水平相关。既往研究表明巨噬细胞通过释放炎性细胞因子和趋化因子来影响PCa进展，且PCa组织中高浸润的M1巨噬细胞与患者预后相关 [18]。以上结果揭示了LIX1可能通过巨噬细胞来影响了PCa患者的临床结果。但本研究结果基于数据库挖掘分析，具有一定的局限性，LIX1对PCa具体机制及生物学作用仍待进一步研究证实。
综上所述，本研究表明LIX1在PCa中表达显著降低，且PCa低表达与患者的临床特征和不良预后相关，为深入探究LIX1在PCa中的发挥的作用提供了参考依据。
基金项目
广西科学基金(2020JJB140154)；桂林医学院博士科研启动基金项目(2021)。
NOTES
*通讯作者。