外泌体在神经性疼痛治疗方面的研究进展

Exosomes in the Treatment of Neuropathic Pain: An Update

摘要: 神经性疼痛(neuropathic pain, NP)是指由功能障碍或神经系统损害所引起的慢性疼痛。NP疾病因诊断不足和治疗不足，对患者和家庭造成了沉重的经济负担。外泌体(exosomes, Exos)作为一种细胞外囊泡，在疼痛中的作用也有着广泛的研究和报道。笔者就外泌体治疗NP的研究进展进行综述，探讨通过外泌体进而影响NP的可能性并探寻相关的治疗方法。

Abstract: Neuropathic pain (NP) refers to chronic pain caused by dysfunction or damage to the nervous sys-tem. Due to inadequate diagnosis and treatment, NP diseases impose a heavy financial burden on patients and families. Exosomes (Exos), as a kind of extracellular vesicles, have also been widely studied and reported for their role in pain. The author mainly reviews the research progress of exosomes in the treatment of NP, explores the possibility of affecting NP through exosomes and the relevant therapeutic methods.

1. 前言

神经性疼痛(neuropathic pain, NP)是一种慢性继发性疼痛，是周围或中枢神经系统病变或疾病的结果。NP具有很高的患病率，约占全球人口的7%~10%，主要集中在50岁以上的人群。这些患者中大多数人的症状在现有的治疗中没有得到令人满意的缓解 [1]，并对患者的生活质量产生深远的影响。现有药物对于治疗NP疗效均不理想，因此急需探寻新的治疗办法。外泌体(exosomes, Exos)是从几种细胞类型释放的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的亚类，并参与细胞之间的旁分泌相互作用 [2]。越来越多的研究认为外泌体是调节生理和病理条件下的生化反应和细胞活性的关键介质。外泌体对特定病理状况如神经退行性疾病、炎症反应和骨关节炎等的关键作用先前已有报道 [3]。中枢神经系统(central nervous system, CNS)和周围神经系统(peripheral nervous system, PNS)内细胞之间的相互交换使这些纳米颗粒成为新的治疗方式。因此，外泌体为治疗NP带来了全新的思路，并有着广阔的研究前景。

2. NP的概述

慢性NP包括外周NP和中枢NP [4]。慢性外周NP的类型又可分为：三叉神经痛(trigeminal neuralgia, TN)、周围神经损伤后的慢性NP、疼痛性多发性神经病、带状疱疹后神经痛和神经根病。慢性中枢NP又可分为以下几种类型：与脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)相关的慢性中枢NP、与脑损伤相关的慢性中枢NP、慢性中枢卒中后疼痛和与多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)相关的慢性中枢NP。NP的发病机制包括外周机制和中枢机制。周围机制包括受损的周围传入纤维的异常放电、神经元混合传递引起的电和交感感觉耦合以及相邻未受损纤维的兴奋性增加。中枢机制包括脊髓背角(spinal dorsal horn, SDH)神经元的致敏、中枢抑制性中间神经元的下降、aβ纤维的萌发、下行促进系统的激活以及较高脑中枢神经胶质细胞的致敏和激活。许多种周围或中枢神经系统疾病可引起慢性疼痛。糖尿病、尿毒症、营养缺乏、化疗药物(长春新碱、紫杉醇、顺铂等)的长期使用可导致神经痛、格林–巴利综合征、带状疱疹后神经痛、进行性神经肌肉萎缩、复杂性区域疼痛综合征I型、缺血性神经病 [5]。

3. 外泌体的特性与功能

外泌体是一种大小从30 nm到140 nm不等的细胞外囊泡，由脂质双层覆盖。在正常和病理条件下，可由体内不同类型的细胞分泌，包括淋巴细胞、肥大细胞、树突状细胞和肿瘤细胞等 [6]。分泌的外泌体可存在于大多数体液中，例如在尿液、母乳、血液、唾液、精液和胆汁中 [7]。外泌体的主要作用通常被认为是作为细胞间通讯的载体，可以通过从亲代细胞递送蛋白质、脂质和核酸(mRNA和miRNA)来诱导受体细胞中的生物反应。外泌体的货物内容物对起源细胞具有特异性，可以将亲本细胞信号传输到相邻细胞或靶细胞，而无需直接细胞与细胞接触。外泌体通过组织–组织和细胞–细胞通讯的方式，有助于维持体内平衡和疾病的愈合 [8]。外泌体可以通过CD9、CD63、CD82、CD81和热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)等特定标志物来进行分类和鉴定 [9]。近年来，对外泌体在疼痛中的作用也有着广泛的研究和报道，外泌体传递信息的能力以及在许多可接触的生物体液中的存在提示了其在疼痛领域的治疗方面具有巨大的潜力。

4. 不同来源的外泌体治疗NP

4.1. 小胶质细胞来源外泌体(Microglia-Derived Exosomes, MDEs)作用

小胶质细胞是定居在中枢神经系统的巨噬细胞，约占神经胶质细胞的5%~20% [10]，主要参与疼痛过程中触诱发痛和热痛觉过敏的产生 [11]。小胶质细胞激活后，可分为M1型和M2型。脂多糖(lipopolvsaccharides, LPS)刺激小胶质细胞活化为M1表型，从而分泌促炎细胞因子。白细胞介素-4 (inteleukin-4, IL-4)刺激小胶质细胞活化为M2表型，负责组织修复和炎症消退 [12]。在中枢神经系统中，小胶质细胞和微血管内皮细胞的邻近空间定位提示小胶质细胞在血管新生和血管病中的不可分割的作用 [13]。越来越多的证据表明，小胶质细胞通过形成血管周围簇和分泌多种因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，basigin-2和成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF2)，表现出促血管生成功能 [14] [15] [16]。

据研究表明，MDEs能够保护脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular endothelial cells, SCMECs)免受氧化应激的毒性作用，促进SCMECs的存活和功能。MDEs可显著降低氧化应激中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，以及NADPH氧化酶2 (NOX2)的蛋白质水平，并可以通过抑制keap1来提高Nrf2和血红素氧合酶1 (Heme Oxygenase-1, HO-1)的蛋白质水平；其还触发了其下游抗氧化相关基因的表达，如NAD(P)H：醌氧化还原酶1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO1)、Gclc、Cat和Gsx1。MDEs在SCI小鼠疼痛模型中表现出对血管再生和细胞增殖以及功能恢复的积极影响。表明MDEs可以通过激活keap1/Nrf2/HO-1信号传导，发挥抗氧化作用，并正向调节SCI后的血管再生和神经功能恢复，进而缓解NP [17]。Luo [18] 等通过构建SCI小鼠疼痛模型，进行了组织学分析和行为测试。数字照片和H & E染色显示M2表型的MDEs处理显著减少受伤区域。此外，BMS评分表明，M2型MDEs刺激显著改善了SCI后的后肢运动功能。电生理分析显示，MDEs给药在SCI后28天表现出高得多的运动诱发电位(MEP)振幅和更短的潜伏期。此外，研究发现M2表型的MDEs诱导的促血管生成作用需要泛素硫酯酶卵泡蛋白(OTULIN)，其能够抑制β-连环蛋白的泛素化来增加其蛋白质水平，从而激活Wnt/β-连环蛋白信号传导，并触发血管生成相关基因的表达，来介导血管生成作用。这些数据表明，MDEs治疗在SCI后NP缓解和功能恢复方面表现出显著改善。

4.2. 神经干细胞来源外泌体(Neural Stem Cell Derived Exosomes, NSCs-Exos)作用

研究表明，NSCs-Exos可以增强SCMECs的血管生成活性，并且VEGF-A中具有很高的富集性。在NSCs中，VEGF-A水平下调，并且抑制了对共培养SCMEC的促血管生成作用。此外，用NSCs-Exos治疗的SCI小鼠疼痛模型中的微血管密度增加、脊髓腔收缩并且运动功能恢复显著，进一步证实了NSCs-Exos缓解SCI疼痛的治疗效果。而通过下调VEGF-A可部分消除NSCs-Exos的这些作用，表明NSCs-Exos通过转移VEGF-A促进微血管再生和组织愈合，促进SCI功能恢复，进而缓解NP [19]。

4.3. 间充质干细胞来源外泌体(Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes, MSC-Exos)作用

Liu [20] 等研究表明，与对照组相比，骨间充质干细胞外泌体(BMSCs-Exos)组在SCI后第28天的平均血管密度增加了近60%，轴突再生增加了近80%。通过一系列体外功能测定，证实用BSMCs-Exos治疗显著增强了人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成，减弱了神经元细胞的凋亡，并抑制了小胶质细胞中的一氧化氮释放。结果表明BMSC-Exos具有较强的促血管生成特性，减弱神经元细胞凋亡，抑制胶质瘢痕形成，缩小病变大小，抑制炎症，促进轴突再生，最终改善NP。研究表明 [21] 通过人胎盘间充质干细胞外泌体(hPMSC-Exos)的给药可促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的形成和迁移。此外，在SCI疼痛模型中，在鞘内注射hPMSC-Exos后，血管数量、血管体积分数和脊髓中的血管连通性显著增加。在SCI疼痛模型小鼠的运动功能测定中，与SCI后21天的对照治疗相比，hPMSC-Exos组的BMS评分显著提高。此外，与SCI后14天的对照治疗相比，hPMSC-Exos组对机械刺激的爪子戒断阈值显着降低。表明小鼠运动和感觉功能有了明显改善，NP得到缓解。Wang [22] 等开发了一种称为EXO-C@P的纳米载体系统，该系统基于由CRISPR/Cas9质粒重塑的人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-Exos)以控制炎症并由CAQK肽修饰，EXO-C@P能够在损伤部位有效积累并使巨噬细胞饱和，以显着降低SCI小鼠模型中炎性细胞因子的表达。CRISPR/Cas9系统中的hucMSC-Exos用于建立具有自动调节和反馈控制的肿瘤坏死因子-α (tumornecrosis factor-α, TNF-α)反应的干细胞，这些细胞分泌可溶肿瘤坏死因子受体1 (sTNFRr1)，中和TNF-α并拮抗TNF-α刺激的炎症。为了确定SCI后小鼠的运动功能恢复和NP缓解情况，研究使用BMS和步态分析进行了详细的行为评估。在恢复过程中，EXO-C@P组的BMS评分明显高于其他组，表明了EXO-C@P组的运动改善效果。手术后42天进行了步态分析，与其他实验组相比，EXO-C@P组的步幅长度、规则性指数和节奏均得到改善。综上所述，EXO-C@P能够促进SCI功能的恢复，缓解NP。

5. 外泌体通过miRNA治疗NP

MicroRNA (miRNA)是负调节多种基因表达的非编码功能RNA。miRNA的序列及其在mRNA中的靶位点在物种间是广泛保守的。通常认为单个miRNA以序列特异性方式识别mRNA的3’-UTR，以转录后抑制数百个靶向mRNA的蛋白表达 [23]。因此，miRNA的表达变化同时调节许多基因表达并对细胞功能具有相当大的影响。miRNA在神经系统的发育和病理生理学中也同样发挥着关键作用 [24]。在外周细胞或组织中表达的miRNA在疼痛性疾病中的作用也有很多报道。

Li等 [25] 报道MDEs可以通过抑制神经元凋亡和促进体内外轴突再生来促进神经功能恢复，缓解NP。miRNA-151-3p在MDEs中含量丰富，是介导MDEs对SCI修复的神经保护作用所必需的。荧光素酶活性测定报告P53是miRNA-151-3p的靶基因，p53/p21/CDK1信号级联参与MDEs中miRNA-151-3p对神经元凋亡和轴突再生的调节。MDEs中高表达的miRNA-151-3p通过抑制神经元凋亡并通过p53/p21/CDK1信号通路促进轴突生长而表现出神经保护作用，进而缓解NP。Zhang等 [26] 研究发现通过鞘内注射，MSC-Exos中miRNA-181c-5p可显著抑制坐骨神经慢性压迫损伤模型(chronic constriction injury, CCI)手术引起的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。在神经损伤反应中，小胶质细胞释放炎症因子，例如白细胞介素-6 (inteleukin-6, IL-6)，白细胞介素-1β (inteleukin-1β, IL-1β)，TNF-α和COX-2。在用LPS刺激小胶质细胞的体外模型中，MSC-Exos中miRNA-181c-5p通过抑制炎性细胞因子IL-6，IL-1β，TNF-α和环氧化酶-2 (COX-2)的分泌进而抑制LPS刺激后小胶质细胞的激活。因此，miRNA-181c-5p鞘内给药可通过抑制神经性炎症减轻CCI大鼠的NP和神经炎症反应。Li等 [27] 发现NOTCH2在脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)疼痛模型大鼠SDH中高水平表达，miRNA-150-5p下调。BMSC-Exos或NOTCH2下调增加了SNL大鼠的后爪撤退阈值(PWT)和爪子撤回潜伏期(PWL)，并减少了SDH的细胞凋亡和炎症。相反，NOTCH2过表达加重机械性异常性疼痛和SDH损伤。此外，抑制BMSC-Exos中的miRNA-150-5p抵消了BMSC-Exos的治疗效果。小胶质细胞活化可诱导野生大鼠机械性异常性疼痛，而BMSC-Exos中miRNA-150-5p可通过靶向小胶质细胞中的NOTCH2来缓解机械性异常性疼痛。Yuan等 [28] 报道在SCI大鼠模型中，miRNA-126修饰的MSC-exos治疗显著减小了损伤体积，保留了神经元细胞，并触发了SCI后的轴突再生，相对于对照组显著改善了大鼠后肢功能的恢复，促进NP的缓解。因此，外泌体可通过miRNA抑制炎症、减少神经元细胞凋亡、促进轴突生成等途径，减轻NP。

6. 总结与展望

由于NP的发病机制目前尚不清楚，而在临床中治疗NP的药物效果不理想，而且价格不菲，给患者和家庭都带来了沉重负担。外泌体颗粒小、组织相容性高。可以透过血脑屏障，因此，作为细胞间的通讯载体，外泌体对于NP的治疗具有一定优势，并可起到协同治疗的作用。尽管目前对外泌体的治疗机制有一定的了解，但其复杂的生物学机制仍需要进一步研究。在临床转化方面仍需要注意许多问题：第一，注意外泌体的细胞来源以及培养条件，外泌体是否纯化。第二，外泌体诱导的治疗效应所依赖的具体机制尚不明确。第三，外泌体特异性到达靶细胞，以及外泌体载药与转运效率该如何进行有效调控。虽然目前外泌体对于NP治疗的直接报道还比较少，但是种种特征显示外泌体对于NP的治疗有着巨大潜力。总之，外泌体很可能成为基础研究的关键和临床应用的新方法，有助于NP的机制探索及治疗进展。

基金项目

国家自然科学基金(81974345)。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]