动脉粥样硬化相关LncRNA的研究

The Research on Long Noncoding RNA Related to Atherosclerosis

摘要: 目的：筛选并验证新的调控动脉粥样硬化的差异lncRNA，为该类疾病的治疗和预后提供新的思路。方法：1) 100 ug/ml ox-LDL刺激人主动脉血管平滑肌细胞24 h作为实验组，正常人主动脉血管平滑肌细胞作为对照组，质检合格后，Trizol法提取总RNA，进行高通量测序，筛选符合标准的表达上调的差异lncRNA。qPCR验证差异lncRNA。2) shRNA慢病毒载体感染HAVSMC，检测目的基因敲减后表达量。3) 将人主动脉血管平滑肌细胞分为正常组、ox-LDL处理组、ox-LDL + shBOLA3-AS1、ox-LDL + shPOC1B-AS1、ox-LDL + shGRXCR1-4，采用CCK8和Transwell法检测各组HAVSMC的增殖迁移能力，ELISA法测定胆固醇水平。结果：1) 初步筛选三种显著表达上调的lncRNA：BOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4。2) 各敲减组中目标lncRNA的表达水平均显著降低(P < 0.05)。3) 下调三种差异基因表达后，与ox-LDL处理组相比，其增殖活性，迁移能力及胆固醇水平均显著降低(P < 0.01)。结论：LncRNABOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4显著表达上调并参与调控动脉粥样硬化的进程。

Abstract: Objective: Filter and verify new regulatory atherosclerosis LncRNA to provide new ideas for the treatment and prognosis of such diseases. Methods: 1) 100 ug/ml ox-LDL stimulates human aortic blood vessel smooth muscle cells for 24 h as the experimental group, and normal people’s aortic blood vessel smooth muscle cells are used as a control group. After qualified quality inspection, to-tal RNA was extracted by Trizol method for high-throughput sequencing to screen the differential lncRNA with upregulated expression that met the criteria. Differential lncRNA was verified by qPCR. 2) HAVSMC was infected with shRNA lentiviral vector, and the expression of target gene was de-tected after knockdown. 3) Select the most effective interference targets, divide human aortic blood vessel smooth muscle cells into normal group, ox-LDL treatment group, ox-LDL + shBOLA3-AS1, ox-LDL + shPOC1B-AS1, ox-LDL + shGRXCR1-4. The CCK8 and Transwell Method were used to detect the proliferation migration capabilities of each group of HAVSMC, and the ELISA method was used to determine cholesterol levels. Results: 1) Preliminary screening of three significant expression of LncRNA: BOLA3-AS1, POC1B-AS1, GRXCR1-4. 2) The expression level of the target LncRNA in each knocking group was significantly reduced (P < 0.05). 3) After the three different genes are lowered, compared with the ox-LDL processing group, its proliferation activity, migration capabilities and cholesterol levels are significantly reduced (P < 0.01). Conclusion: LncRNA BOLA3-AS1, POC1B-AS1, GRXCR1-4 significantly increased and participated in the process of regulating atherosclerosis.

1. 引言

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)主要影响全身大中型动脉，以脂质代谢的障碍，内皮细胞功能的紊乱，平滑肌细胞的增殖和迁移等为特征 [1]。使得动脉血管逐渐狭窄，组织器官缺血坏死。研究表明长链非编码RNA (Lnc RNA)可通过多种途径影响AS的进程，譬如调控转录调节蛋白复合物、结合并调节蛋白质，以及干扰蛋白质翻译等 [2] [3] [4]，并作为其靶点进行干预和治疗。但是目前还不足以完全阐释相关机制。借助高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)的发展，一些非编码RNA，譬如lncRNAs、snoRNAs、和microRNAs，已经被系统地描述 [5]。本研究借助HTS，利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人主动脉血管平滑肌细胞(Human aortic blood vessel smooth muscle cell, HAVSMC)作为模型，筛选验证表达量显著上调的差异lnc RNA，并通过功能实验进一步验证其对AS的作用。

2. 实验材料和方法

2.1. 实验材料

RPMI1640和DMEM、Transwell试剂盒购自corning公司；胎牛血清(FBS)购自invitrogen和Ausbian；Penicillin-Streptomycin(100x)购自Gibco；人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)、BOLA3-AS1 shRNA、GRXCR1-4 shRNA、POC1B-AS1 shRNA慢病毒载体购自上海懿贝瑞生物医药公司；Trizol购自Sigma；qPCR相关购自Vazyme和金唯智公司；CCK-8试剂购自Sigma公司。

2.2. 实验方法

2.2.1. 细胞分组及样品质检

将HA-VSMC接种于10%胎牛血清培养基，添加青霉素降低污染，于37℃，5% CO₂培养箱中培养，取对数生长期细胞分成两组：一组加用100 μg/mL氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激24 h，另一组不加用，每组三个重复，用于后续实验。利用Trizol法抽提各组样本细胞中的总RNA，对总RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计，测量RNA的浓度、A260/280吸光值比率分别为1.97、1.97、1.98、1.92、1.93、1.92显示其1.7 < A260/A280 < 2.2，表明样本质检符合后续实验要求，可继续后续实验。

2.2.2. 高通量测序

1) 数据预处理

对上述质检合格样品送上海生物芯片有限公司行高通量测序，由于原始测序数据中含有测序接头序列，有些读序中含有质量较低的碱基、末端质量偏低等不合格情况，这些可能影响到后续分析结果的可靠性，故采用Seqtk软件对原始数据进行预处理，去除接头序列、低质量读序。

2) 差异lncRNA分析

应用edgeR软件包进行样本间差异 lncRNA分析，在本次实验中，P-value使用BH法进行校正(FDR)。显著性差异基因的筛选标准为：|Fold Change| ≥ 1.3且FDR < 0.05。根据结果挑选5个差异的表达上调的lncRNA后续验证。

2.2.3. qPCR检测基因表达

运用Trizol法提取细胞的总RNA，分光光度计测定浓度。根据逆转录试剂盒说明书进行反转录成cDNA备用。根据筛选出的lncRNA设计上游引物和下游引物，引物序列如下，见表1。两步法进行Real-Time PCR，其中包括2 ul的cDNA模板，各0.25 ul的上下游引物。设定程序95℃，1 min；95℃，10 s；60℃，30 s；循环45次。最后数据信息采集与保存。获取相应数据，并检测每个样本的循环数即Ct值，使用2^−ΔΔCt法来计算各差异基因的相对表达量。

Table 1. Primer sequence

表1. 引物序列

2.2.4. qPCR检测基因敲低效率

将人主动脉血管平滑肌细胞分为空白组(CON)、阴性对照组(shCtrl)、实验组。实验组分别转染上海懿贝瑞生物公司提供的shBOLA3-AS1，shGRXCR1-4，shPOC1B-AS1，转染48 h后，参照2.2.3采用qPCR测得各组目标基因的相对表达量，验证基因敲减能力。

2.2.5. CCK8检测细胞活力

将人主动脉血管平滑肌细胞及转染shBOLA3-AS1，shGRXCR1-4，shPOC1B-AS148h后的分为：正常组(NC)；ox-LDL处理组；ox-LDL + shBOLA3-AS1组；ox-LDL + shGRXCR1-4组；ox-LDL + sh POC1B-AS1组，每组三个重复，制成细胞悬液，收集细胞后接种于96孔板，培养箱中培养一段时间(37℃, 5% CO₂)，每孔加10 ul CCK8，设定0 h、24 h、48 h、72 h时间点，酶标仪测定450 nm 处的各孔吸光度(OD)，表示增殖活力，活力计算公式：细胞活力(%) = [OD(实验) − OD(空白)]/[OD(对照) − OD(空白)] × 100%。

2.2.6. Transwell检测细胞迁移能力

分组同2.2.5，胰酶消化后，低血清培养基重悬，无血清培养基稀释。加细胞悬液100 uL (含 100000~200000)于小室中，将小室放入含600 uL 30% FBS培养基的下室中，培养箱培养24 h，倒扣吸水纸上去除培养基，棉拭子擦去非转移细胞，400 ul染液染色5 min，冲洗晾干，显微镜下计数膜细胞数目，以细胞数反应迁移能力。

2.2.7. 检测细胞胆固醇水平

将人主动脉血管平滑肌细胞分组为：正常组(NC)；ox-LDL处理组；ox-LDL + shBOLA3-AS1；ox-LDL + shGRXCR1-4；ox-LDL + shPOC1B-AS1，严格按ELISA检测试剂盒说明书操作，设标准品孔，空白对照孔和待测样品孔，再通过加样、温育、配液等操作后显色，37℃避光显色15分钟，然后每孔加终止液50 μl，观察颜色变化(蓝色变黄色，即为终止)。加终止液15 min内测定：以空白孔调零，500 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品对应的浓度和OD值可计算直线回归方程，再根据待测样品OD值计算浓度。

2.3. 统计学分析

采用SPSS 26.0进行统计分析，采用GraphPad Prism 9.0作图软件进行统计作图。数据运用 $\bar{x}\pm s$ 表示，2组间均数采用t检验，P < 0.05有统计学意义。

3. 实验结果

3.1. 高通量测序结果

将探针信号均值小于0.005的探针予以滤除，符合筛选标准，结果显示568个显著性上调基因，428个显著性下调基因。其中，初步挑选了5个显著表达上调的lncRNA，见表2。

Table 2. Five differentially expressed lncRNAs with significantly up-regulated expression

表2. 5个表达显著上调的差异lncRNA

备注：Inf无穷大。

3.2. QPCR验证5个差异基因

结果表明：与正常组相比，ox-LDL组的lncGRXCR1-4、POC1B-AS1、BOLA3-AS1的表达显著增加(P < 0.05)，差异有统计学意义，见图1。

Figure 1. qPCR detection and verification of target lncRNA

图1. qPCR检测验证目标lncRNA

3.3. 敲减3种差异基因

qPCR检测3个基因敲减后的表达量，CON组和shBOLA3-AS1组相对表达量1.001 ± 0.056、和0.336 ± 0.004；CON组和shGRXCR1-4组相对表达量为1.001 ± 0.044和0.531 ± 0.015；CON组和shPOC1B-AS1组相对表达量为1.000 ± 0.020和0.616 ± 0.017。与CON组相比，各敲减组中BOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4基因表达水平均显著降低(P < 0.05)，有统计学意义，敲减有效。

3.4. CCK8检测细胞活性

正常组培养0 h、24 h、48 h、72 h的OD值分别是：0.197300 ± 0.001308、0.501467 ± 0.014841、0.729967 ± 0.026494、1.142200 ± 0.009395；ox-LDL + shBOLA3-AS1组培养0 h、24 h、48 h、72 h的OD值分别是：0.202967 ± 0.010050、0.403133 ± 0.001858、0.650067 ± 0.000321、0.879867 ± 0.064943；ox-LDL + shPOC1B-AS1组培养0 h、24 h、48 h、72 h的OD值分别是：0.194733 ± 0.003044、0.404867 ± 0.006837、0.618833 ± 0.002548、0.859867 ± 0.016916；ox-LDL + shGRXCR1-4组培养0 h、24 h、48 h、72 h的OD值分别是：0.186133 ± 0.004412、0.314100 ± 0.006767、0.520633 ± 0.009672、0.767033 ± 0.020232；与正常组相比，ox-LDL + shBOLA3-AS1、ox-LDL + shGRXCR1-4、ox-LDL + shPOC1B-AS1组细胞活性显著降低(P < 0.01)，差异有统计学意义。

3.5. 敲减后细胞迁移能力的比较

结果见表3，与ox-LDL组相比，基因抑制组细胞迁移水平显著降低(P < 0.01)，差异有统计学意义。

3.6. 敲减后各组胆固醇浓度的比较

结果见图2，与正常组相比，ox-LDL组胆固醇量明显升高(P < 0.001)；与ox-LDL组相比，基因抑制组胆固醇含量均显著降低(P < 0.001)，差异有统计学意义。

Table 3. Cell migration number in each group

表3. 各组细胞迁移数目

Figure 2. Cholesterol content in each group detected by ELISA

图2. ELISA检测各组胆固醇含量

4. 讨论

4.1. 高通量测序与LncRNA

运用高通量测序技术研究诸多疾病的相关lncRNA也逐渐成为热点 [6] [7] [8] [9]。Sun等 [10] 用高通量测序检测胸主动脉夹层(TAD)和正常主动脉组织，预测异常表达的lncRNA，并qPCR验证lncRNA XIST和p21在TAD中高表达，hasmiR-17-5p在TAD中低表达。Yang等 [11] 运用高通量测序，比较2型糖尿病患者和正常者之间差异基因，亦发现441个lncRNA，其中366个上调，75个下调。另外，Liao通过对冠心病组和健康对照组之间进行高通量测序，分析lncRNACTA-384D8.35和CTB-114C7.4为该类疾病的关键基因 [12]。在本次实验里，同样运用高通量测序技术，并以P < 0.05，差异倍数|FoldChange| > 1.3作为筛选标准。然而一般默认FC的绝对值大于2，但在本次实验中，以此标准可能会造成实验的差异基因数目过低，导致某些与AS确实有关的lncRNA被筛除，故以FC > 1.3选取表达上调的差异lncRNA。

4.2. 动脉粥样硬化与LncRNA

动脉粥样硬化的发生发展，使得心脑血管疾病发生率居高不下 [13] [14] [15]。研究表明，lncRNA在AS中扮演着重要的角色。Bai等人 [16] 证实lncRNA meg3使mir-26a海绵化，同时促进samd1的表达，调节动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的增殖/凋亡平衡，影响AS的进展。Wang等人 [17] 也研究出foxc2-as1通过mir-1253/foxf1信号轴进一步促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。另外，lncRNA H19也有报道显示，表达量增加时，粥样硬化斑块随之也会增大，促进氧化型低密度脂蛋白(ox-ldl)诱导的巨噬细胞的脂质积累，降低mir-146a-5p的表达 [18]。Liu等人 [19] 探讨了长链非编码RNA MALAT1在氧化低密度脂蛋白的摄取、脂质积累和总胆固醇水平方面，与mir-17-5p/abca1轴的关系。在本次研究中，我们运用ox-LDL刺激HA-VSMC 24 h，然后质检高通量测序，初步筛选并通过qPCR验证三种表达显著上调的差异lncRNA：BOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4，可能通过某种分子机制参与调控动脉粥样硬化的进程。查阅目前文献，BOLA3-AS1与肿瘤预后相关，Wei等人 [20] 在研究新的预测胃癌预后相关lncRNA标志物时发现，BOLA3-AS1在胃癌细胞系表达较正常胃细胞系中的上调，并且通过构建风险模型来预测胃癌患者预后。此外，它也可作为糖酵解相关的lncRNA来预测子宫内膜癌患者的生存预后，Jiang等 [21] 研究发现，包括BOLA3-AS1在内的5个糖酵解相关的基因，成功的将三个独立队列中的每个人分成了生存结果显著不同的高风险和低风险亚组，达到对子宫内膜癌的稳健的预测效果。还有研究显示，与结肠癌的预后免疫及治疗敏感性有关 [22]。同样，POC1B-AS1也可作为构建子宫内膜癌预后模型的lncRNA，将计算风险比(HR)用于自噬相关的lncRNAs，分类为POC1B-AS1则为保护因素(HR < 1)，且高表达患者的总生存率显着长于低表达患者 [23]。另外在结肠腺癌 [24]，在半月板退化 [25] 等方面也发挥着一定的调控作用。长链非编码RNA GRXCR1-4鲜有文献报道。因此，就三种差异lncRNA而言，常作为肿瘤疾病预后模型的因素，在AS中扮演的角色尚无法揭示。但也有研究表明，肿瘤与动脉粥样硬化也是相关的 [26] [27] [28]，包括有共同的危险因素：三高、遗传等，相同的病理机制：炎症，血管新生，细胞增殖凋亡及低密度脂蛋白胆固醇水平升高等。这也证实了差异lncRNA是可以影响AS的进程。因此，为进一步证实lncRNABOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4是AS进展中的调控原件，在本次研究中，将三种基因通过构建敲低质粒转染的方式，抑制其在HA-VSMC中的表达，然后通过Transwell，CCK8及ELISA方法进行功能实验。检测各组中的细胞活性，增殖迁移能力，及胆固醇水平。发现伴随三种基因的表达量的下降，其平滑肌细胞的增殖迁移能力、胆固醇水平降低。而相对正常组，ox-LDL处理组却是升高的。故进一步证实长链非编码RNABOLA3-AS1、POC1B-AS1、GRXCR1-4在动脉粥样硬化进程中发挥着重要的调控作用。

综上所述，通过高通量测序及QPCR等生物技术的应用，筛选验证出lncRNA BOLA3-AS1、GRXCR1-4、POC1B-AS1与动脉粥样硬化有关，并且通过降低三种基因表达后发现，人主动脉血管平滑肌细胞的增殖活性、迁移能力，胆固醇水平也随之降低，而这些是造成AS重要的危险因素。另外，因为资金和人力、时间的限制，其具体机制并未深入研究，尚不清楚，此外未对表达量显著下降的差异lncRNA进行对比分析，造成对AS影响结果的片面性。抑制差异基因表达时，亦仅仅单一抑制，未考虑差异基因互作的影响。但是，本次研究亦为AS的治疗和预后提供新的干扰靶点，进一步完善与AS相关的lncRNA家族。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者Email: wshy63@ sina.com