乙醇替代丙酮测定水中叶绿素a的优化实验研究

Experimental Optimization Study on the Determination of Chlorophyll a in Water by Substituting Acetone with Ethanol

摘要: 叶绿素a是评价水体富营养化的重要指标，多所高校的环境类专业开设了“丙酮–分光光度法测定水中叶绿素a含量”的本科教学实验。丙酮具有较强挥发性和一定毒性，具有特殊气味，在使用中可能对实验人员造成危害，增加了实验成本和风险性。为了倡导绿色化学，针对这一问题本文探讨了现有国内外测定方法，并实验研究了乙醇法替代丙酮法的可行性，优化了实验参数。实验结果表明：乙醇和丙酮的提取时间对测定结果均有显著性影响，酸化时间对乙醇–分光光度法的测定结果没有显著性影响；乙醇–分光光度法在提取时间为15 h、酸化时间为5 min时，与丙酮法结果最接近。乙醇法替代丙酮法作为大学本科教学实验《水中叶绿素a含量的测定》的教学方法是可行的。本文提供了可用于高校本科实验教学的减排优化实验方案，也可为其它研究院所、工矿企业，环保部门进行叶绿素a测定技能培训教学提供服务。

Abstract: Chlorophyll a is an important indicator to evaluate the eutrophication of water bodies, and the undergraduate teaching experiment of “acetone-spectrophotometric determination of chlorophyll a content in water” has been introduced in the environmental majors of many universities. Acetone has strong volatility and toxicity, and has a special odor, which may cause harm to the ex-perimenters and increase the cost and risk of the experiment. In order to advocate green chemistry, this paper discusses the existing domestic and international determination methods, and ex-perimentally investigates the feasibility of the ethanol method instead of acetone method, and op-timizes the experimental parameters. The experimental results showed that the extraction time of both ethanol and acetone had a significant effect on the determination results, and the acidification time had no significant effect on the determination results of the ethanol-spectrophotometric method; the results of the ethanol-spectrophotometric method were closest to those of the acetone method when the extraction time was 15 h and the acidification time was 5 min. The ethanol method is feasible to replace the acetone method as a teaching method for the undergraduate teaching experiment “Determination of chlorophyll a content in water”. This paper provides an optimized experimental scheme for emission reduction that can be used for undergraduate ex-perimental teaching in universities, and can also be used for training and teaching of chlorophyll a determination skills in other research institutes, industrial and mining enterprises, and environ-mental protection departments.

1. 引言

叶绿素a (chlorophyll a)作为光合色素叶绿素的其中一类，存在于所有的浮游植物中。它能够反映浮游植物的生物量乃至初级生产力水平，因此常作为评价水体富营养化的重要参数之一，通过测定叶绿素a含量，可以确定水体中藻类及浮游植物等的分布和数量，从而进一步了解该区域的水质状况及生态状况等信息 [1]。因此叶绿素a的测定在环境监测以及水质评价中起着重要的实用意义。

目前，国内多所高校的环境工程专业及环境科学专业在本科阶段就开设了“水中叶绿素a含量的测定”这一实验项目。在高校开设的实验课程中，用以提取叶绿素a的试剂通常为丙酮。然而丙酮溶液具有极易挥发性、易燃且有一定急性毒性。使用丙酮作为提取试剂进行高校实验教学，在通风设施条件不佳的情况下，丙酮极易挥发到实验室内，对师生的健康及人身安全造成潜在威胁。此外，掺有丙酮的实验室废液属于危险废物，不能直接倾倒到下水道内，须要收集到废液桶中，由学校组织有危废处理资质的公司统一回收处理，上述处理方式无疑增加了各高校开设该实验项目的环境污染风险、师生健康威胁和经济成本。以某大学环境工程专业为例，参与该实验项目的学生人数为100人/年，实验中划分为每组3人共33组，则每组实验需要消耗丙酮约100 mL，一次教学实验需要消耗丙酮约3300 mL，产生含有丙酮的危险废液约40 kg，按照每公斤危废处理费用30元计算，则一年需要支付1200元左右的丙酮废液处理费用，增加了高校实验开设的成本和风险。因此，寻找该实验项目的更为环保的代替实验方法具有十分重要的现实意义。

2. 国内外水中叶绿素a测定方法研究进展

2.1. 国内外现有的叶绿素a的标准测定方法

叶绿素a含量的测定方法主要在以下几种公开发布的规范文本中进行说明，表1、表2分别分析比较了国内和国外公开的主要标准测定方法。

Table 1. Analysis and comparison of the main methods for the determination of chlorophyll a in China

表1. 国内叶绿素a的主要测定方法分析比较

Table 2. Analysis and comparison of the main foreign methods for the determination of chlorophyll a

表2. 国外叶绿素a的主要测定方法分析比较

2.2. 叶绿素a测定仪器的研究进展

当前测定水中叶绿素a含量的方法主要有荧光法、高效液相色谱(HPLC)法和分光光度法三种。其中，荧光法的检测结果易受到水中悬浮物的干扰，且影响程度随时间延长迅速升高，根据黄倩 [14] 等人研究得出，水样采集超过30分钟后运用荧光法测定的叶绿素a含量结果出现明显变化，仅1小时后叶绿素a含量就下降40%左右，因此荧光法多用于实地科考过程中大批量样品的现场测定；康琦 [15] 研究表明HPLC法测定结果准确但仪器设备昂贵且操作复杂，测定步骤繁琐，对实验人员要求较高，且测量结果与分光光度法的结果差异不大。对比分析如下表3所示。

Table 3. Comparison of the advantages and disadvantages of the instruments required for common methods of determining chlorophyll a in water

表3. 水中叶绿素a常见测定方法所需仪器的优劣对比

从上文及上表3可得，鉴于高效液相色谱法及荧光法所需仪器设备昂贵，操作复杂，对场地要求严格，并不适用于本科实验教学环境，而分光光度法相较而言更加简单易操作，实验器材易得，检测效率较高，在教学实验操作中更占优势。因此，在本科实验教学中首选分光光度法进行测定最为合理。

2.3. 分光光度法测定叶绿素a的预处理研究进展

目前，测定叶绿素a含量中研究较多的强化预处理提取方法有直接浸泡提取法、浸泡研磨提取法、超声波提取法及反复冻融提取法。表4为水中叶绿素a常见提取方法的对比。

Table 4. Comparison of the advantages and disadvantages of common extraction methods of chlorophyll a in water

表4. 水中叶绿素a常见提取方法的优劣对比

结合表4分析，浸泡研磨提取法操作简便可行，且提取效率较高，适宜作为高校实验教学及小型实验中的叶绿素a提取方法，因此可以选用浸泡研磨提取法进行本文实验研究过程中叶绿素a的提取。

除了标准方法中用到的丙酮，可提取水中叶绿素a的提取试剂还有乙醇，甲醇及二甲基亚砜(DMSO)等。

甲醇一般不作为单独的提取试剂使用，而是在某些特定情况下与其他的提取试剂按比例混合使用，这样可以达到比单独使用甲醇试剂更好的提取效果。例如在针对某些藻类如蓝藻、绿藻等的提取上，90%甲醇溶液或者纯甲醇提取的检测结果不如90%丙酮溶液或者丙酮甲醇混合溶液提取的检测结果快速、准确，因此在本次实验研究中不考虑选用 [16]。

用作提取试剂的还有二甲基亚砜，它的提取效果与丙酮相差无几，但是由于该溶剂本身气味难闻，在温度小于18.5℃时容易结晶，使用度不高 [17]。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，能够使叶绿素a具有更长时间的稳定性，针对叶绿素a含量较低的水样的检测效果较好，但是DMF在与很多种试剂共存时都具有潜在的危险，未知的安全风险大，因而不适用于实验教学。

乙醇作为已知最安全环保的光合色素提取试剂，主要用以提取检测淡水水样的叶绿素a含量，不适用于对海洋水样的检测。根据李鹏飞 [18] 等人研究，无水乙醇-90%丙酮混合溶液在比例为1:2时的提取效果最好，无水乙醇单独用作提取试剂的效果次之。此外，还有按照一定比例混合的有机溶剂混合溶液如DMSO-丙酮、乙醇–丙酮等。

Table 5. Comparison of reagents for the extraction of chlorophyll a in water

表5. 水中叶绿素a的提取试剂的比较

由上文及表5可得，无水乙醇是以上五种提取试剂中最安全环保无污染的试剂。乙醇是否能代替丙酮应用于叶绿素a测定方法的教学，以及如何优化达到最佳条件，需要做详细的实验研究。

目前，绿色化学在多个国家都已经成为化学进展的主要方向之一，其核心内容为倡导用化学的技术和方法减少或停止那些对人类健康、社区安全、生态环境有害的原料、催化剂、溶剂和试剂、产物、副产物等的使用与产生 [19]。因此，寻找一种无毒或者毒性较小的试剂或方法，来代替丙酮溶剂法进行叶绿素a含量的测定方法进行实验教学，不仅是对绿色化学的强烈认同与响应，也与高校环境类专业培养方案的目标一致。

3. 实验方法

3.1. 实验材料

在实验室人工养殖小球藻，取一定量的含有小球藻的水样用蒸馏水稀释到“丙酮萃取–分光光度法”检测范围内，作为实验水样备用。

3.2. 实验方法及步骤

对同一水样，在实验室内分别采用乙醇和丙酮进行提取，然后用分光光度法进行测量。具体方法如下：

3.2.1. 乙醇–分光光度法

1) 测定步骤

a) 抽滤

据预实验确定的稀释浓度，取稀释后的水样500 mL，通过装好玻璃纤维滤膜的抽滤装置进行过滤，抽滤时负压应不大于50 kPa。抽滤完后，对折滤膜并用普通滤纸吸压以尽可能除去滤纸上的水分。

b) 提取

用玻璃研钵研磨提取。将滤膜放入研钵后加入90%乙醇溶液7~8 mL，研磨3~5 min直至变为匀浆。将匀浆移入10 mL的离心管中并冲洗研钵移入离心管中，终容积略小于10 mL。盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取，提取时间分别设置为6、15和24 h。

c) 离心

将提取后的离心管放入离心机中，转速1000 rpm，离心10 min。离心后得到的上层叶绿素提取液移入定量试管中，然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素a的提取液，将提取液定容至10 mL。

d) 测定

将90%乙醇溶液作为参照液调分光光度计零点，调零后测定定容后的提取液在665 nm和750 nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差，记为A₁；然后向比色皿中加入1滴1 mol/L的盐酸酸化，酸化时间分别设为5、6、7、8、9、10 min，再次测定酸化后的提取液在665 nm和750 nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A₂。空白样品与试样测定相同的步骤进行。

2) 计算公式 [20]

提取液中的叶绿素a的浓度为：

$\text{Chla}=\frac{27.9\times \left(A_1-A_2\right)\times V_{提取液}}{V}$ (1)

其中Chla为水样中的叶绿素a浓度(μg/L)；A₁为V_提取液为提取液的最终定容体积(mL)；V为抽滤水样的体积(L)。

3.2.2. 丙酮–分光光度法

丙酮–分光光度法测定叶绿素a含量的测定步骤和计算公式参照国家环境保护局颁布的标准方法《水质叶绿素a的测定分光光度法》(HJ 897-2017) [2]。

1) 测定步骤

根据预实验确定的稀释浓度，取稀释后的水样500 mL，运用玻璃砂芯过滤器与玻璃纤维滤膜进行抽滤。抽滤后有样品的一面向内将滤膜对折，用滤纸吸干水分。将滤纸放入玻璃研钵中，少量多次加入提取试剂并充分研磨五分钟以上。将研磨后的样品转移至离心管中定容至10毫升，然后避光低温浸泡提取，提取时间分别设置为6 h、15 h、24 h。

浸泡完成后将之离心10 min，转速1000 r/min。离心完成后用针式过滤器过滤上清液得到提取液。将提取试剂作为参照液(提取试剂放在参照比色皿中，并用其调分光光度计零点)。测定提取液在不同波长处的吸光度，并计算得到叶绿素a含量测量值。

在上述实验步骤中，使用丙酮作为提取试剂时，需要注意的主要有两点：一是在使用玻璃砂芯过滤器抽滤时，当滤液剩余10毫升左右时加入0.2 mL的碳酸镁悬浊液摇匀再一同过滤；二是需要在750 nm、664 nm、647 nm和630 nm波长处测定吸光度，需要注意的是，在750 nm处测定的吸光度应当小于0.005，否则需要再次用针式过滤器过滤后再次测定，这是因为吸光度大于0.05说明提取液中仍然含有较多的沉淀物，因此需要重复过滤 [21]。

2) 计算公式

提取液中叶绿素a的浓度计算公式如下：

${\rho }_1=11.85\times \left(A_{664}-A_{750}\right)-1.54\times \left(A_{647}-A_{750}\right)-0.08\times \left(A_{630}-A_{750}\right)$ (2)

式中： ${\rho }_1$ 为提取液中叶绿素a的质量浓度(mg/L)；A_n为提取液在波长为n时的吸光度值。

水样的叶绿素a质量浓度计算公式如下：

$\text{Chla}=\frac{{\rho }_1\times V_1}{V}$ (3)

式中：Chla为水样中叶绿素a的质量浓度(μg/L)；V₁为提取液的定容体积(mL)；V为所取水样的体积(L) [22]。

将以上实验步骤和计算方法得到的原始数据用Graph Pad Prism 8.0软件进行数据处理与图形绘制。

3.2.3. 实验数据处理方法

实验数据用IBM SPSS Statistics 22软件进行处理，Graph Pad Prism8.0软件进行图形绘制。

4. 实验结果分析

4.1. 乙醇–分光光度法测定水中叶绿素a的实验结果分析

4.1.1. 乙醇提取6 h下酸化时间对叶绿素a测定结果分析

Figure 1. Effect of acidification time on chlorophyll a determination results at 6 h of ethanol extraction

图1. 乙醇提取6 h下酸化时间对叶绿素a测定结果的影响

经过SPSS软件进行数据分析得出，当提取时间为6 h时，酸化时间对叶绿素a测定结果没有显著性影响(P = 0.710 > 0.05)。

由图1可知，当提取时间为6 h时，叶绿素a浓度在酸化时间为6 min时出现最大值，随后检测值呈下降趋势，在10 min时出现最小值。

4.1.2. 乙醇提取15 h下酸化时间对叶绿素a测定结果分析

Figure 2. Effect of acidification time on chlorophyll a determination results at 15 h of ethanol extraction

图2. 乙醇提取15 h下酸化时间对叶绿素a测定结果的影响

经过SPSS软件进行数据分析得出，当提取时间为15 h时，酸化时间对叶绿素a测定结果没有显著性影响(P = 0.976 > 0.05)。

由图2可知，当提取时间为15 h时，叶绿素a浓度在酸化时间为6 min、7 min时出现最大值，随后检测值呈下降趋势，到10 min时再次增大。

4.1.3. 乙醇提取24 h下酸化时间对叶绿素a测定结果分析

Figure 3. Effect of acidification time on chlorophyll a determination results at 24 h of ethanol extraction

图3. 乙醇提取24 h下酸化时间对叶绿素a测定结果的影响

经过SPSS软件进行数据分析得出，当提取时间为24 h时，酸化时间对叶绿素a测定结果没有显著性影响(P = 1.000 > 0.05)。

由图3可知，当提取时间为24 h时，叶绿素a浓度在酸化时间为7 min、8 min时出现最大值，随后检测值呈下降趋势，在第10 min时再次出现最大值。

4.1.4. 小结

酸化时间在5~10 min对乙醇–分光光度法的测定结果影响并不显著，不同酸化时间下测定的叶绿素a含量结果，对水样营养程度的定性判定影响不大。因此，在选用乙醇作为叶绿素a的提取试剂时，在酸化时间为10 min以内测定都是可行的，但考虑到时间成本，酸化时间选定为5 min。

4.2. 丙酮–分光光度法测定水中叶绿素a的实验结果分析

用丙酮–分光光度法在不同提取时间下的叶绿素a含量检测结果如下图4所示。

Figure 4. Comparison of the results of chlorophyll a content detection by acetone at different extraction times

图4. 丙酮在不同提取时间下的叶绿素a含量检测结果对比

由图4分析可知，自提取6 h起至24 h止，叶绿素a含量检测数值随着提取时间的增长而降低，最佳提取时间在6小时。分析原因如下：丙酮对叶绿素a的提取效果较强，提取较大含量的叶绿素a所需的时间较短，即在6小时左右就能提取出绝大部分色素。随着提取时间的延长，溶解到丙酮中的叶绿素a逐步进行分解反应，渐渐消耗，导致在15 h以及24 h的叶绿素a测量值显著降低。水利行业标准更新后将原标准中规定的提取时间由24 h变更为4~12 h，这一变更与本文的实验结果也是相吻合的 [23]。

综上可见，在丙酮–分光光度法中，提取时间对提取叶绿素a的效果以及测量值的准确度有很大影响。丙酮溶剂在不同的提取时间的测定值均存在较大差异，因此把握适当的提取时间对于分光光度法测量叶绿素a含量是非常重要的。在本实验探究中，认为对于丙酮而言，提取时间在6小时有较好的提取效果。

4.3. 乙醇–分光光度法和丙酮-分光光度法的测定结果对比

4.3.1. 提取6 h下乙醇法和丙酮法结果对比

Figure 5. Differences in chlorophyll a content determination for different extraction reagents at 6 h of extraction

图5. 提取6 h下不同提取试剂的叶绿素a含量测定差异

由图5可知，当提取时间为6 h时，乙醇的检测结果比丙酮小39%。

4.3.2. 提取15 h下乙醇法和丙酮法结果对比

Figure 6. Differences in chlorophyll a content determination for different extraction reagents at 15 h of extraction

图6. 提取15 h下不同提取试剂的叶绿素a含量测定差异

由图6可知，当提取时间为15 h时，乙醇的检测结果比丙酮大12%。

4.3.3. 提取24 h下乙醇法和丙酮法结果对比

Figure 7. Differences in chlorophyll a content determination for different extraction reagents at 24 h of extraction

图7. 提取24 h下不同提取试剂的叶绿素a含量测定差异

由图7可知，当提取时间为24 h时，乙醇的检测结果比丙酮大23%。

小结：据以上数据分析可知：分别用丙酮和乙醇作提取试剂时，二者检测结果有一定差异，当提取时间为15 h时两者检测结果差值最小，为12%。

4.3.4. 丙酮及乙醇分别在最佳提取条件下的叶绿素a测定值对比

Table 6. Comparison of the differences in the measured chlorophyll a content between acetone and ethanol at the optimal extraction time, respectively

表6. 丙酮及乙醇分别在最佳提取时间下的叶绿素a含量测定值对比差异

由表6可知，在最佳优化条件下，对同一水样乙醇法测定结果为102.40 μg/L，丙酮法测定结果为116.42 μg/L，乙醇法的测定结果略小于丙酮法的测定结果，差值为12%。

4.4. 小结

根据以上数据结果及分析，优化后的乙醇法测定结果比丙酮法的测定结果小12%。为了尽可能减少有毒试剂的使用，用乙醇代替丙酮作为提取剂，进行叶绿素a的测定实验教学或操作训练是可行的。

优化得到的乙醇法实验步骤如下：

1) 选用90%乙醇作为提取试剂，采用研磨浸泡提取法进行强化预处理，黑暗低温环境下浸泡提取15小时；

2) 离心后取上清液定容到10 mL，在665 nm和750 nm处分别测定其吸光度，其差值记为A1；

3) 然后向比色皿中加入1滴1 mol/L的盐酸酸化，酸化时间为5 min，再分别在665 nm和750 nm处测定其吸光度值，其差值记为A2；

4) 代入公式(1)计算可得叶绿素a含量。

5. 结论

根据本研究实验，得出以下结论：

1) 采用乙醇–分光光度法测定水中叶绿素a，酸化时间对测定结果影响不显著，

2) 采用乙醇–分光光度法测定水中叶绿素a，乙醇提取时间对测定结果影响显著，当提取时间15 h时，测得的叶绿素a值高于提取时间6 h和24 h时的测定结果。

3) 采用丙酮–分光光度法测定水中叶绿素a，丙酮提取时间对测定结果影响显著。提取时间6 h时，测得的叶绿素a值显著高于其它两种情况，提取时间24 h测定的叶绿素a值最低。

4) 经优化后的乙醇–分光光度法，提取时间为15 h，酸化时间为5 min，其测定结果比丙酮–分光光度法小12%。

为了尽可能减少有毒试剂的使用，用乙醇代替丙酮作为提取剂，可节约危化废液的处置费用，也可避免实验中丙酮挥发对人体健康的造成的潜在威胁。经本研究优化后的乙醇–分光光度法作为实验教学和操作训练中叶绿素a测定方法的减排代替方法是可行的。

NOTES

^*通讯作者。