摘要: 目的：以盐酸小檗碱为考察指标建立硝英洗液正交试验优化工艺。方法：采用HPLC法，以Wonda Sil C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱，乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为265 nm，柱温为30℃；用正交试验法优化对硝英洗剂的提取工艺优化。结果：盐酸小檗碱在0.078125 mg/mL~0.125 mg/mL范围内，线性关系良好，回归方程y = 19947x − 8.6951，R2 = 1；盐酸小檗碱平均加样回收率(n = 6)为99.19% (RSD = 1.45%)；正交试验结果为加水12倍量水，煎煮3次，每次45 min。结论：本实验建立以盐酸小檗碱为最佳工艺的硝英洗液提取工艺，该工艺方法合理、工艺可靠，可以作为大生产的提取条件。
Abstract:
Objective: To establish the orthogonal test optimization process of Xiaoyin xiji with the small sacilline hydrochloride as the inspection index. Methods: Using HPLC method, the color column of Wonda Sil C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 m) was used, and the acetylene-0.1% phosphoric acid solution (50:50) for the flow phase, flow rate of 1.0 mL/min, detection wavelength of 265 nm, column temperature of 30 degrees C, with orthogonal test method to optimize the extraction process of Xiaoyin xiji. Results: Small carbapenum hydrochloride at 0.078125 mg/mL to 0.125 mg/mL range, the linear relationship is good, and the regression equation y = 19947x − 8.6951, R2 = 1. The average sample recovery was 99.19% (n = 6), RSD was 1.45%. Conclusion: In this experiment, the Xiaoyin xiji extraction process with hydrochloric acid as the best process is es-tablished, which is reasonable and reliable, and can be used as the extraction condition for large-scale production.
1. 引言
中药坐浴在治疗肛肠性疾病中具有独特的疗效，研究发现，术后应用中药坐浴能有效的提高伤口愈合率 [1]，同时中药坐浴在联合针灸在治疗肛门其他相关疾病中也具有较好的疗效，如肛门瘙痒、肛门湿疹、肛门疼痛等疾病 [2] [3] [4] [5]。硝英洗剂原名肛肠洗剂，为阜阳市中医医院市级重点专科肛肠科协定处方，方中由金银花、蒲公英、芒硝、延胡索、黄柏等12味中药组成，该方具有清热解毒，活血止痛的功效。临床上用于炎性外痔，血栓外痔，肛痈，肛瘘的术后熏洗坐浴，临床疗效较好 [6]。方中以芒硝、黄柏、蒲公英为君药，黄柏具有较强的抑菌、抗炎等功效 [7] [8]，蒲公英清热解毒、消肿散结；辅以乳香、没药、赤石脂活血定痛，消肿生肌，敛疮生机等。
为了有效地控制我院硝英洗剂的质量，保证临床药效，对硝英洗剂的提取工艺进行研究，以硝英洗剂中黄柏中盐酸小檗碱为考察指标，采用正交试验对其提取工艺进行优化，以高效液相色谱法对硝英洗剂中黄柏的成分盐酸小檗碱。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
Agilent1260II高效液相色谱仪；Wonda Sil C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；梅特勒ME55十万分之一分析天平，JK-DY300型超声波清洗器(输出功率300 W，工作频率40 kHz)；上海市力辰邦西数显恒温水浴锅。
2.2. 试药
对照品盐酸小檗碱(批号110713-202015，纯度85.9%)及对照药材均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2.3. 色谱条件选择 [9]
参照2020版《中国药典》中黄柏中盐酸小檗碱色谱条件：流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(50:50)；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：30℃；进样量10 μL。
2.4. 对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定(12.5 mg)，加50%甲醇溶液至100 mL量瓶定容，超声处理30 min，过0.45 μm微孔滤膜，置于5℃冰箱中备用。
2.5. 供试品溶液的制备
用移液管移取硝英洗剂样品5 mL溶液转移至100 mL容量瓶，加80 mL 50%甲醇溶液，超声40 min；0.45 μm微孔滤膜过滤。
2.6. 阴性对照溶液的制备
用移液管分别移取不含黄柏的硝英洗剂；采用3.3制备方法制备。
2.7. 专属性实验
精密吸取对照品溶液、硝英洗液样品溶液、阴性对照品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪进行测定。色谱峰结果显示，对照品溶液和供试品溶液盐酸小檗碱种成分的保留时间一致，且阴性对照品溶液无干扰，表明该方法专属性良好，见图1。
Figure 1. HPLC chromatograms of reference substance (a) Berberine hydrochloride, (b) sample, (c) negative sample
图1. (a) 盐酸小檗碱，(b) 硝英洗液样品，(c) 阴性样品
2.8. 线性关系
分别吸取“2.2”项下0.078125 mg/ml、0.01563 mg/ml、0.03125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.125 mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液进样，测定峰面积。以进样量(X, mg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，制备标准曲线。得盐酸小檗碱的回归方程y = 19947x − 8.6951，R2 = 1，盐酸小檗碱在0.078125 mg/ml~0.125 mg/ml范围内，线性关系良好。
2.9. 稳定性实验
取同一样品溶液，按照样品溶液制备方法制备，分别在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样，按照上述色谱条件进样，根据所得峰面积计算盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.18%，说明样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.10. 精密度考察
精密吸取同一盐酸小檗碱对照品溶液，连续进样6次，计算盐酸小檗碱物质峰面积的RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。
2.11. 重复性实验
精密称取同一供试品样品，平行6份，按照样品溶液制备方法制备及进样，盐酸小檗碱含量的RSD为0.68%，表明该方法的重复性良好。
2.12. 加样回收率考察
精密移取同批样品6份(批号20210801)，每份5 mL，精密称重，分别精密加入浓度为0.078125 mg/mL盐酸小檗碱对照品80 ml，密塞称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；按含量测定项下的方法测定供试品溶液中盐酸小檗碱含量，结果表明RSD为1.45%。照“2.6.1项”下色谱条件测定，计算其加样回收率，详见表1。
Table 1. The results of recovery tests (n = 6)
表1. 加样回收率的实验(n = 6)
3. 正交试验
3.1. 正交试验设计
以加水量、煎煮时间、煎煮次数进行正交试验。采用L3(9)分析组合，因素水平见表2，试验设计结果见表3。
Table 2. Factors and levels of orthogonal tests
表2. 因素水平表
Table 3. The results of orthogonal test (n = 3)
表3. 正交试验结果表(n = 3)
3.2. 盐酸小檗碱含量极差分析
直观分析可以看出：以盐酸小檗碱含量为考察指标，加水量12 > 10 > 8，煎煮时间45 > 75 > 60，煎煮次数3 > 2 > 1。对盐酸小檗碱含量进行极差分析，如表4所示。
Table 4. The results of variance analysis
表4. 盐酸小檗碱含量极差分析表
从极差表可以看出，对盐酸小檗碱含量影响顺序为：煎煮次数 > 煎煮时间 > 加水量，其中最优方案组合为煎煮次数3、煎煮时间45、加水量12。
3.3. 盐酸小檗碱含量趋势图
从各因素对极差的趋势图(图2)，可以看出，随着加水量的增大盐酸小檗碱含量增大，随着煎煮时间的增大，盐酸小檗碱含量先减小后增大；随着煎煮次数的增大，盐酸小檗碱含量先减大后缓慢减小。
3.4. 最佳水提工艺的验证
按以上最佳水提工艺，即加入处方量12倍量水，提取3次，每次45 min，测定小檗碱平均含量(表3)。由表5的验证试验结果可知，优化后的水提工艺可行、稳定、重现性好，可应用于大量生产。
Figure 2. Sample content trend chart of Berberine hydrochloride
图2. 盐酸小檗碱含量趋势图
Table 5. The optimum conditions of Xiaoying xiye
表5. 硝英洗液最佳工艺验证
4. 讨论
硝英洗液处方中黄柏具有较强的抗炎作用，现代药理研究表明黄柏中盐酸小檗碱具有较强的抗炎、抗病毒作用 [10] [11]。同时，方中金银花、蒲公英也具有抗炎作用 [12] [13]，但在研究中发现，金银花及蒲公英中所含的咖啡酸及绿原酸为苯丙素类物质，在处方中其它药物也具有绿原酸及咖啡酸类，阴性干扰较大，而处方黄柏中盐酸小檗碱阴性无干扰，故本研究采用黄柏中盐酸小檗碱作为最终质量标志物，并以此进行工艺考察。通过正交试验考察发现，盐酸小檗碱的转移率及稳定均较好，可以作为硝英洗液定量标准。
在工艺考察中发现，本处方中有芒硝及矿石类物质赤石脂，赤石脂具有敛疮生肌功效，但提取后溶液静置后赤石脂会沉降在底部，从而对出膏率及相对密度的测定产生一定影响，本研究在考察相对密度时，将硝英洗液进行摇匀后在进行测定，以达到相对密度测定的稳定性。同时，在浓缩工艺研究中发现，不同浓缩温度对盐酸小檗碱的影响差异不大，考虑到实际生产中可能应为水压导致浓缩温度变化，故本研究最终的浓缩温度定在65℃~70℃之间，以便更好的控制质量和生产。
基金项目
阜阳市卫健委科研课题(FY2019-079)。
NOTES
*通讯作者。