1. 引言
全球肿瘤呈年轻化、发病率高和死亡率高趋势，攻克癌症和延长肿瘤患者生存期任重道远。乳腺癌是常见的肿瘤，其发病率在女性恶性肿瘤排第一，占妇女肿瘤的30% [1]。外科手术切除是治疗早期乳腺癌有效的方法。然而，仍可能存在一些癌症细胞，导致乳腺癌复发和转移 [2]。抑制乳腺癌生长和转移是治疗乳腺癌的首选策略，可延长患者生存期 [3]。lncRNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类普遍存在于哺乳动物，长度大于200 bp的非编码RNA [4]。lncRNA在乳腺癌生长和转移中发挥着重要作用 [5]。临床前研究利用反义寡核苷酸靶向MALAT1有效抑制乳腺癌的转移 [6]，提示着lncRNA在乳腺癌进展中起着重要作用，是乳腺癌治疗的潜在靶点。许多临床研究表明胆固醇和肿瘤发生成正相关 [7]，胆固醇也是乳腺癌发生的危险因素 [8]。更多的临床证据和体外实验表明使用降胆固醇药物他汀类延长无病生存期(disease-free-survival, DFS)，防止乳腺癌复发和转移 [9]。lncRNA与胆固醇代谢调控关系以及它们在乳腺癌中作用和分子机制尚未清楚。我们此篇论文旨在寻找特异性的lncRNA，研究其是否调控胆固醇代谢和乳腺癌生长作用，并进一步阐明其分子机制。
2. 材料与方法
2.1. 细胞培养
正常乳腺上皮细胞MCF-10A购自ATCC，采用MCF-10A专用培养基培养(上海语纯生物科技公司)。MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3、BT483和MDA-MB-468细胞为实验室自存细胞，于完全培养基无菌于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。
2.2. 试剂耗材
Real time PCR的SYBER Green和逆转录酶试剂盒购自Takara公司。RNA提取试剂盒购自康为世纪公司和Qigen公司。siSREBF2-AS小分子干扰片段购自锐博公司。转染试剂Lipo 2000和RNA MAX购自Invtrogen公司。细胞培养液购自Hyclone公司。细胞培养皿购自康宁公司。MTT和BrDu试剂盒购自北京鼎国公司。
2.3. 实验方法
1) 细胞增殖活力测定(MTT法)
取对数生长肝癌癌细胞，接种细胞到96孔板中，每孔加入250 ml细胞悬液，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；细胞贴壁后，融合度达到80%左右，瞬时转染小分子干扰片段或过表达质粒，随后加入100 µl的MTT工作液(浓度为5 mg/ml)，继续培养4小时；吸除上清后每孔加入1 ml二甲基亚砜(DMSO)，摇床震荡摇匀，用酶标仪测定OD570的光密度值。实验中每组设6个复孔，重复3次。
2) BrdU实验
在六孔板内放入一块盖玻片，乳腺癌细胞接种于六孔板中，转染siSREBF2-AS1，固定，5% Triton穿孔，孵育BrdU抗体，荧光检测。
3) Annexin V凋亡实验
乳腺癌细胞转染siSREBF2-AS1，用秋水仙碱做阳性对照。收集细胞加入Annexin V和PI室温避光染色，流式细胞仪分析凋亡率。
4) qRT-PCR实验
qRT-PCR检测SREBF2-AS、SREBF2和胆固醇合成代谢相关基因的转录瓶。具体实验如下：收集处理后的乳腺癌细胞RNA，逆转录为cDNA，用Takara公司的SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验PCR条件为：95℃ 30 s，1个循环；PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 15 s，45个循环；溶解，95℃ 0 s，65℃ 20 s，95℃ 0 s，1个循环。PCR结束后，根据反应得到的Cp值，使用相对定量的分析方法，以标准曲线进行校正，最后计算出样品中各mRNA的相对浓度。进行qRT-PCR引物序列如表1。
Table 1. Real-time fluorescence quantitative PCR primers
表 1. 实时荧光定量PCR引物
5) 过表达质粒或小分子干扰片段转染
转染试剂为Lipo 2000 (Invitrogen公司)，详细操作步骤见说明书。乳腺癌细胞转染4~6个小时后换上普通培养液，在不同的待测时间点，收细胞蛋白或RNA进行相应分析。
2.4. 统计分析
正态分布数据采用t检验统计方法进行组间比较分析，P < 0.05为显著差异。所有实验重复3次。非正态分布数据采用秩和检验。
3. 实验结果
3.1. 乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中SREBF2-AS表达
为了研究SREBF2-AS在乳腺癌中表达，我们设计SREBF2-AS引物，采用RT-PCR检测乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中SREBF2-AS水平。以乳腺上皮细胞MCF-10A为对照组，分别收集乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MDA-MA-436、MDA-MB-231、BT-483和SKBR3的RNA。此外，也收集30例乳腺癌病人的癌组织和癌旁组织进行SREBF2-AS检测。结果显示显示，乳腺癌细胞株中SREBF2-AS水平明显高于乳腺正常细胞MCF-10A (图1(a))。与此对应，乳腺癌组织中SREBF2-AS水平明显高于癌旁组织(图1(b))。
(a) SREBF2-AS乳腺癌细胞株水平。RT-PCR检测乳腺癌细胞株SREBF2-AS水平；(b) SREBF2-AS乳腺癌组织中水平。RT-PCR检测乳腺癌组织中SREBF2-AS水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
Figure 1. The relative expression of SREBF2-AS in breast cancer cell line and breast cancer
图1. 乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中SREBF2-AS水平
3.2. SREBF2-AS在乳腺癌中生长作用
为了研究SREBF2-AS在乳腺癌中作用，我们首先合成小分子干扰片段敲低SREBF2-AS水平，然后采用MTT、BrdU和流式细胞技术检测SREBF2-AS对乳腺癌作用。结果显示，干扰SREBF2-AS后，明显抑制了乳腺癌的生长(图2(a)~(d))。此外，干扰SREBF2-AS后也诱导乳腺癌细胞凋亡(图2(e))。
3.3. SREBF2-AS调控胆固醇代谢途径
为了研究SREBF2-AS调控乳腺癌生长作用分子机制，我们首先进行转录组测序分析。转录组测序分析结果显示，干扰SREBF2-AS后，主要影响胆固醇代谢合成途径(图3(a))和下调胆固醇合成途径相关基因转录(图3(b))。此外，体外实验干扰SREBF2-AS后也明显抑制胆固醇合成代谢途径中MSMO1、SQLE、MVK、IDI1、MVD、MVK、HMGCR和HMGCS1表达(图3(c))。
3.4. SREBF2-AS调控SREBF2和胆固醇代谢促进乳腺癌的生长
固醇调节元件结合转录因子2 (sterol regulatory element transcription factior 2, SREBF2)是调节细胞脂质合成代谢的中心枢纽和主要的转录因子，其主要通过调控脂质合成代谢过程中相关基因的表达进而调节脂质合成代谢 [10]。为了研究SREBF2-AS通过调控SREBF2进而调控胆固醇途径和乳腺癌生长，我们首先研究SREBF2-AS是否调控SREBF2表达。结果显示，干扰SREBF2-AS后，明显抑制SREBF2表达(图4(a))，而干扰掉SREBF2也明显抑制胆固醇合成途径相关基因水平(图4(b))。此外，我们发现在干扰SREBF2-AS同时过表达SREBF2，明显消除了SREBF2-AS调控胆固醇合成作用和乳腺癌生长作用(图4(c)，图4(d))，表明SREBF2-AS通过调控SREBF2和胆固醇代谢促进乳腺癌的生长。
(a)和(b) MTT实验检测MDA-MB-231 (a)和SKBR3 (b)的生长情况；(c)和(d) BrdU实验检测MDA-MB-231 (c)和SKBR3 (d)的增殖情况；(e) Annexin V凋亡实验检测乳腺癌凋亡情况。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
Figure 2. The role of SREBF2-AS on breast cancer growth
图2. SREBF2-AS1调控乳腺癌生长作用
(a) KEGG pathway分析干扰SREBF2-AS1后转录组变化富集的信号通路；(b) 转录组测序结果中胆固醇合成代谢过程相关基因的变化；(c) 干扰SREBF2-AS1后胆固醇合成代谢过程相关基因表达。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
Figure 3. SREBF2-AS regulates cholesterol metabolism of breast cancer
图3. SREBF2-AS1调控胆固醇合成代谢途径
(a) 干扰SREBF2-AS1后SREBF2的mRNA水平；(b) 干扰SREBF2后胆固醇合成代谢相关基因的表达；(c)和(d) 干扰SREBF2-AS1的同时过表达SREBF2，检测乳腺癌的胆固醇含量(c)和增殖情况(d)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
Figure 4. SREBF2-AS regulates cholesterol metabolism and growth of breast cancer via SREBF2
图4. SREBF2-AS1通过调控SREBF2进而调控胆固醇合成代谢及乳腺癌生长
4. 讨论
目前乳腺癌的治疗方案有外科手术、放疗、化疗、激素治疗、靶向治疗和免疫治疗等。外科手术切除是治疗早期乳腺癌有效的方法。然而，仍可能存在一些癌症细胞，导致乳腺癌复发和转移 [2]。抑制乳腺癌生长和转移是治疗乳腺癌的首选策略，可延长患者生存期 [3]。lncRNA在乳腺癌生长和转移中发挥着重要作用 [5]。临床前研究利用反义寡核苷酸靶向MALAT1有效抑制乳腺癌的转移 [6]，提示着lncRNA在乳腺癌进展中起着重要作用，是乳腺癌治疗的潜在靶点。我们前期实验通过lncRNA芯片分析发现lncRNA-SREBF2-AS1在乳腺癌组织中高表达，随后qRT-PCR结果也证明SREBF2-AS1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高表达。进一步的功能实验表明，干扰掉SREBF2-AS1后抑制乳腺癌的生长和诱导其凋亡。但是其分子机制尚未清楚。
许多临床研究表明胆固醇和肿瘤发生成正相关 [7]，胆固醇也是乳腺癌发生的危险因素 [8]。更多的临床证据和体外实验表明使用降胆固醇药物他汀类延长无病生存期(disease-free-survival, DFS)，防止乳腺癌复发和转移 [11]。而我们通过转录组测序分析结果表明，沉默SREBF2-AS1后主要影响胆固醇合成代谢通路。沉默SREBF2-AS1后明显抑制胆固醇合成代谢过程中相关基因HMGCS1，HMGCR，MVK，IDI1，FDFT1，SQLE和MSMO1的表达。固醇调节元件结合转录因子(sterol regulatory element transcription factiors, SREBFs)是调节细胞脂质合成代谢的中心枢纽和主要的转录因子，其主要通过调控脂质合成代谢过程中相关基因的表达进而调节脂质合成代谢 [10]。哺乳动物SREBFs家族主要有SREBF1和SREBF2两种基因，分别编码SREBF1和SREBF2蛋白 [12]。SREBF1主要激活脂酸合成代谢相关基因的转录，而SREBF2是胆固醇合成代谢过程的主要转录因子，激活胆固醇合成代谢过程中限速酶HMGCR及其它基因转录 [13]。我们研究发现干扰SREBF2-AS后，明显抑制SREBF2表达，而干扰掉SREBF2也明显抑制胆固醇合成途径相关基因水平，表明SREBF2-AS通过调控SREBF2调控胆固醇代谢途径。本文我们进一步发现在干扰SREBF2-AS同时表达SREBF2，明显消除了SREBF2-AS调控胆固醇合成作用和乳腺癌生长作用，表明SREBF2-AS通过调控SREBF2调控胆固醇代谢和合成，进而促进乳腺癌的生长。本文还需在动物实验水平确认SREBF2-AS对乳腺癌生长作用以及阐明SREBF2-AS调控SREBF2分子机制。
基金项目
国家自然科学基金(项目编号81901557，81902693)。广东省自然科学基金(项目编号2022A1515012513)。