1. 引言
纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称 [1]，包括外切葡聚糖苷酶、内葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，在食品、饲料、医药、纺织、造纸等工业领域有广阔的应用前景 [2]。纤维素酶广泛分布于自然界中的真菌、细菌和古菌中……目前工业级水解酶活性较高的代表菌种为里氏木霉、康氏木霉和黑曲霉 [3]。作为生物燃料产业的关键酶系，纤维素酶在工业应用中需要适应一些特殊的物化环境，如高温、高盐、强酸、强碱等 [4]。所以从自然界中，特别是高盐度、极酸、极碱、高温的极端环境中筛选纤维素酶产生菌一直是学者们研究的热点 [5]。从这些环境中筛选产纤维素酶的优良菌株，除了寻找高活力的产酶菌外，再就是寻找能耐受极端环境的纤维素酶，这对于工业生产具有巨大的运用潜力。
嗜盐微生物指较高浓度盐存在时，才能生存和生长的微生物 [6]。一些嗜盐微生物能够在高盐，高pH的培养基中存活，甚至也能在高温下进行培养，那么使用嗜盐微生物作为研究对象可以使发酵过程保持无菌、不被污染，从而能进行长时间连续发酵 [7]。嗜盐耐盐真菌具有独特的耐盐机制，并且往往能够产生特殊的代谢产物，对于工业生产抗生素、有机酸、工业酶制剂、改善植物抗盐抗旱和开发新型材料等有着重要意义 [8]。因此，嗜盐真菌是一类极具研究价值的微生物。
很多研究证明嗜盐真菌具有很多特殊活性。据报道，在西班牙南部不同的高盐环境中，盐生芽孢杆菌属、盐单胞菌属和盐生芽孢杆菌属分别产生大量淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶 [9]。在来自海洋杆菌属的中度嗜盐菌、来自突尼斯太阳盐场的色卤杆菌属和卤单胞菌属中也观察到水解酶产生能力 [10]。侯靖等人于一平浪盐矿筛选产胞外蛋白酶菌株盐矿盐古球菌Halococcus salifodinae具有蛋白酶活性 [11]；张辞海等从双峰盐场中筛选出嗜盐菌特氏盐芽孢杆菌Halobacillus trueperi具有最高的蛋白酶活力 [12]；张伟等筛选出耐盐性菌株Halorubrum sp.，具有产α-淀粉酶的能力 [13]。林佳辉等筛选的中盐菌株Salinicola sp.，具有烷烃降解特性 [14]。赵娜娜等筛选的嗜盐菌株Halomonas sp.具有高效降酚能力 [15]。随着世界各地盐碱化程度的加重和工业需求的增加，挖掘产纤维素酶且具有特殊活性的能降解纤维素的耐盐和嗜盐微生物的分离筛选具有研究价值。
本研究从茶卡盐湖土壤样品中，筛选获得一株产纤维素酶嗜盐真菌，并对其形态学和产纤维素酶性质进行研究，旨在为嗜盐纤维素酶的开发和应用研究提供依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 样品
样品采自青海省茶卡盐湖(海拔约3059 m，99˚02'0.85''E，36˚31'0.51''N)水平面下15 cm处的水样，4℃暂存。
2.1.2. 培养基
选择培养基(g/L)：小麦秸秆10 g，土豆200 g，NaCl 50 g，琼脂20 g，pH自然。
刚果红筛选培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠1 g，KH2PO4 1 g，K2HPO4 2FeSO4∙7H2O 1 g，NaCl 25 g/50 g，(NH4)2SO4 2 g，MgSO4∙7H2O 1.2 g，K2HPO4 1 g，CaCl2 0.3 g，酵母粉0.5 g，蛋白胨0.5 g/L琼脂20 g。
发酵培养基(g/L)：小麦秸秆10 g，KH2PO4 1 g，K2HPO4 2FeSO4∙7H2O 1 g，NaCl 50 g，(NH4)2SO4 2 g，MgSO4∙7H2O 1.2 g，K2HPO4 1 g，CaCl2 0.3 g、酵母粉0.5 g。灭菌条件：121℃，0.12 MPa灭菌30 min。
2.2. 产纤维素酶嗜盐菌株的分离
取1 mL样品，分别稀释为10−3，10−4，10−5，涂布在选择培养基上，在25℃下培养；待菌落长出后，挑取单个菌落进行平板划线培养，重复划线3~5次后实现菌株的分离与纯化，获得菌株的纯培养。利用刚果红—羧甲基纤维素钠水解圈法进行初筛，将菌株点接于筛选培养基上，培养3~5 d后，用0.1%刚果红溶液染色20 min，再用1 mol/L NaCl溶液洗脱25 min，依据水解圈与菌落的直径比来初步判断纤维素酶高产菌株，再将活性菌株接种于发酵培养基中培养10 d，利用胞外酶活测定法作为复筛法进行菌株的筛选。发酵条件：25℃180 r/min培养6 d后，4℃、8000× g离心15 min收取上清液，作为粗酶液用于酶学特性的测定。
2.3. 菌株的鉴定
2.3.1. 菌株的形态观察
将菌株接种于PDA培养基上25℃培养10 d，观察记录菌落的大小、质地、颜色、边缘情况等。利用OLYMPUS BX51荧光显微镜对所制片内的菌体进行微观拍照，拍摄的图片需要记录其菌丝、分生孢子梗、产孢细胞形状大小和分生孢子的形态大小等特征。
2.3.2. 分子生物学鉴定
挑取少量真菌菌丝于50 µL含2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)的TE缓冲液(pH 8.5)中，于PCR仪下99℃沸水浴45 min，10,000× g离心10 min，取上清液作为真菌基因组模板。利用真菌核糖体rDNA基因间隔区序列(ITS)通用引物(ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’, ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，使用Taq酶进行PCR扩增。将PCR扩增产物送擎科生物科技有限公司进行测序。得到的序列校正后提交到GenBank中，并进行Blast比对。利用MEGA7.0使用邻接法(neighbor joining)构建系统进化树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株的种属。
2.4. 粗酶液中纤维素酶活性测定
将菌株接种于液体发酵培养基中，25℃下培养10 d，取发酵液在8000 r∙min−1、4℃条件下离心20 min，上清即为粗酶液。取50 µL粗酶液加入到250 µL含1% (W/V)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)柠檬酸钠缓冲液(pH)中，55℃孵育30 min。加入450 µL (3,5)-二硝基水杨酸(DNS)终止反应，沸水浴10 min后，使用酶标仪于540 nm下测定还原糖的释放量 [16]。一个单位(U)的酶活性定义为1 min释放1 µmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量，每组反应均进行3个生物学重复。所得结果用prism.exe软件进行绘图分析。
2.5. 最适反应pH和温度的测定
为测定F39来源纤维素酶最适反应pH，在55℃下使用pH 2到10的缓冲液检测不同pH对粗酶液的影响。柠檬酸钠缓冲液(pH 2.0~8.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8~10.0)。为测定F39来源纤维素酶最适反应温度，在柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)中检测不同温度(0℃~90℃)对粗酶液的影响。
2.6. pH和温度对维素酶稳定性的影响
pH对F39来源纤维素酶稳定性的影响，通过将100 µL粗酶液加入400 µL缓冲液(pH 2、3、4、5、6、7、8、9和10)中，于4℃下孵育24 h后，在标准条件下测定其残留活性。以生理盐水(0.9% NaCl, pH 7.0)同等稀释粗酶液为阳性对照(100%)。温度对F39来源纤维素酶稳定性的影响，通过将粗酶液在不同温度(45℃、55℃和65℃)下，孵育不同时间(0、20、40、60、80、100和120 min)后，在标准条件下测定其残留活性，以未处理(0 min)粗酶液为阳性对照(100%)。
2.7. 盐浓度对纤维素酶活力的影响
为测定F39来源纤维素酶最适反应盐浓度，在55℃、pH 5下使用不同盐浓度缓冲液检测不同盐浓度对粗酶液的影响。配置不同浓度的NaCl缓冲液，称取0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 g的NaCl溶解在1 mL缓冲液中，为测定F39来源纤维素酶在柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)中检测不同浓度(0~3.5 g/mL)对粗酶液的影响，测定其残留活性。使用标准条件下，未添加NaCl的反应混合物作为对照(100%)。
2.8. 不同金属离子和抑制剂对纤维素酶活力的影响
为测定金属离子和抑制剂对F39来源纤维素酶的影响，在标准的反应体系中分别加入不同的金属离子(K+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Ni2+、Ba2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Al3+)至浓度为1 mmol/L，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和不同抑制剂[十二烷基硫酸钠(SDS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)]至浓度为0.1%。使用标准条件下，无添加剂的反应混合物作为对照(100%)。
2.9. 培养时间对产酶的影响
将F39菌株于PDA培养基中，30℃下培养3 d的培养物作为种子液，取种子液以1% (V/V)接种量接种于发酵培养基中，180 r/min，30℃下进行培养间隔12 h，连续收取上清液，用于纤维素酶活力的测定。
3. 结果与分析
3.1. 产纤维素酶菌株筛选结果
通过选择培养基分离到一株具有纤维素酶活性的嗜盐真菌，将其命名为F39。该菌株的刚果红水解圈见图1，水解圈直径与菌落直径比为2.26 ± 0.14。
Figure 1. Congo red hydrolytic circle of strain F39
图1. 菌株F39刚果红水解圈
3.2. 产纤维素酶菌株F39的形态特征
图2为菌株F39的微观形态，由图可知，该菌株菌体外形棕色微绿，培养基表面绒毛状菌丝，菌丝体直、弯曲，具分枝，亚透明到橄榄棕色。分生孢子梗直立，颜色茎顶端略微减弱，橄榄棕色，光滑和厚壁，产孢末端和侧面由架空菌丝产生，双分枝，隔片。分生孢子呈简单和分支链，亚透明至橄榄棕色，形状和大小可变，亚球形、椭球卵形、卵形、梭形，亚圆柱形，斜形，光滑至轻微粗糙壁。
Figure 2. Colony morphology and microscopic characteristics of F39. (a), (b): Pure culture colonies; (c), (f): Conidiophore and conidia; (d), (e): Conidiophore; (g): Conidia
图2. 菌株 F39的菌落形态学和显微形态特征。注：(a)，(b)：纯培养菌落；(c)，(f)：分生孢子梗和分生孢子；(d)，(e)：分生孢子梗；(g)：分生孢子
3.3. 产纤维素酶菌株F39的分子进化树构建
通过ITS通用引物测序获得bp ITS rRNA核苷酸序列，序列在线上传至GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，登录号：ON318388，与菌株Cladosporiaceae sp. (登录号：OL818314)和Cladosporium sp. (登录号：MZ452398)亲缘关系最近，同源性分别为99.44%和99.44%。基于菌株F39 ITS序列在NCBI数据库中同源系列构建系统进化树，见图3，可知菌株F39与枝孢菌属聚在一枝，结合形态学特征，最终确定F39为Cladosporium sp.菌株。
Figure 3. The phylogenetic tree of F39 based on ITS rRNA sequence homology
图3. 基于ITS rRNA序列同源性构建菌株F39的系统进化树
注：相对酶活表示在一定条件范围内的相对酶活性(酶活性与酶最大活性的百分比)；残留活性表示酶在不同条件下处理后残余酶在最适宜温度下测出的活性。
Figure 4. Effects of temperature and pH on cellulase activity from strain F39
图4. 温度和pH对菌株F39来源纤维素酶活性的影响
3.4. 菌株F39来源纤维素酶的最适反应pH和温度
菌株F39来源纤维素酶的最适反应pH和温度分别为pH 5和55℃ (图4)。F39来源粗酶液在45℃~65℃，表现出最高活性80%以上的相对活性(图4(a))；在5℃和80℃分别表现出约40%和37%的相对活性(图4(a))。F39来源粗酶液在pH 5，表现出最高活性80%以上的相对活性；在pH 3.5~7，表现出超过40%的相对活性(图4(c))。这说明F39来源纤维素酶系为嗜酸、嗜热纤维素酶。此外，粗酶液在5℃~70℃，仍表现出40%以上的相对酶活，说明该纤维素酶系表现出良好的热稳定性。
3.5. 温度和pH对F39来源纤维素酶稳定性的影响
F39来源粗酶液表现出较高稳定性(图4(b))，在45℃、55℃和65℃下孵育120 min后，分别保留约85%、54%和32%的相对活性，其在65℃下的半衰期为40 min。55℃下的半衰期为120 min。pH对F39来源纤维素酶稳定性的影响表明粗酶液在pH 5孵育24 h后，表现出较高的稳定性(>80%)，在pH 6和pH 7下孵育12 h后，其活性提高了9%。
3.6. 盐浓度变化对纤维素酶活力的影响
Figure 5. Effect of salt concentration on cellulase activity from F39
图5. 盐浓度对F39的来源纤维素酶活力的影响
测定不同盐浓度(盐质量g/mL)底物对F39的来源纤维素酶活力在的影响。由图5可以看到，盐浓度在0.1~0.5 g/mL间，测得其相对活力分别为105.61%，129.93%，111.23%，105.%，100.49%，该盐浓度范围内对F39产纤维素酶的活力有促进作用。F39来源粗酶液在盐度为0.2 g/mL时，表现出强烈促进作用，相对酶活力提高至129.93%。盐浓度高于0.5 g/mL时，表现出抑制作用，随着盐度增加，相对酶活逐渐降低，盐浓度低于2.5 g/mL时，保持降至60%以上相对酶活。当盐浓度为3.5 g/mL，相对酶活降至25%。
3.7. 不同金属离子和抑制剂对菌株F39来源纤维素酶的影响
不同金属离子和抑制剂对菌株F39来源纤维素酶的影响见图6。酶反应中添加1 mol/L金属离子，所有测试的金属离子对粗酶液纤维素酶活性均无抑制作用，Mn2+能激其活性至最高活性。其余测试金属离子对粗酶液纤维素酶活力无显著影响。0.1%浓度的抑制剂EDTA和PSMF对F39来源的纤维素酶活力均有稍微促进作用(见图7)，0.1% SDS和DTT对其活性有强烈促进作用，是该酶强的促进剂。
3.8. 不同培养时间对菌株F39产纤维素酶的影响
菌株F39在发酵培养基中培养48 h后，随着培养时间的增加其上清液纤维素酶活性不断提高，144 h时，相对酶活超过20%，随后酶活力大幅度增加，264 h后其活性趋于稳定，达到最高活性的80%，至312 h时达到最高活性，为0.223 U/mL (图8)。312 h后，活性开始降低，到408 h时，仍维持最高活性的80%以上。
Figure 6. Effect of metal ions on cellulase activity from F39
图6. 金属离子对F39的来源纤维素酶活力的影响
Figure 7. Effect of inhibitor on cellulase activity from F39
图7. 抑制剂对F39的来源纤维素酶活力的影响
Figure 8. Effects of different culturetime on the cellulase production of F39. The fermentation medium was inoculated with 1% inoculum and incubated under 180 r/min, at 30℃. Cellulase activity of fermentation broth supernatant was measured by sampling at 1 day interval
图8. 不同培养时间对菌株F39产纤维素酶的影响。以1%接种量接种于发酵培养基中，180 r/min，30℃下进行培养，间隔1 d取样测定发酵液上清的纤维素酶活性
4. 讨论
嗜盐真菌是一类生活在高盐生境中的极端微生物，可以在3.0 mol/L甚至更高的盐浓度下生长的微生物 [17]。嗜盐真菌易于在高盐环境中生长，能够极大程度地减少发酵过程中其他微生物的污染，并能产生极端酶和其他特殊生物活性物质 [18]。极端盐碱环境微生物所产酶系可在高盐碱环境中仍保持酶活性。因此，这类极端微生物产纤维素酶的筛选、基因克隆及高效表达已成为国内外研究热点。本研究从青海查卡盐湖土壤样品中筛选出1株降解小麦渣、玉米秆渣的真菌菌株F39，其产纤维素酶的产酶温适宜度范围和pH分别为45℃~65℃和pH 5，在其条件下酶活力测得0.237 U/mL。经发育系统学分析，鉴定F39菌株是枝孢球属枝孢菌Cladosporium sp.，是纤维素降解菌的主要类群，分离于盐环境中，其生长温度为25℃，最适产酶盐度为0.2 g/mL，属于典型的嗜盐真菌，产生的纤维素酶在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。Cladosporium sp. F39菌株与王垚等人从高盐环境诺邓火腿上分离的一株具有产纤维素酶能力的Cladosporium sphaerospermum菌株，同为枝孢属 [19]。我们从盐湖中分离的这株Cladosporium sp.菌株产纤维素酶具有耐酸、耐盐能力，在酸性或高盐环境种保持降解纤维素的能力，在特殊环境中显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。该研究说明极端盐环境中筛选特殊活性的嗜盐真菌值得在科学理论探索和生产应用中开展更深入的研究。
致谢
本研究获得云南省基础研究专项——青年项目(202101AU070138)、大理苍山高海拔真菌多样性科学考察和大理大学高层次人才科研启动费支持。
NOTES
*通讯作者。