1. 引言
持留菌是细菌在受到有效抗菌药物作用时，绝大部分细菌很快死亡的同时残留下的一部分代谢活动低下，具有同基因型多药物耐受(Multidrug Tolerance, MDT)特性的细菌亚群 [1]。持留菌的数量少于细菌总体的0.1%，但在遭遇外界压力时，持留菌可作为“幸存者”而成为保证细菌种群生存的重要策略，一旦停止使用抗生素，持留菌又会复苏，成为慢性感染疾病迁延不愈的重要原因。持留菌的生理特点主要是代谢水平极低、蛋白质合成减少、ATP数量减少、抗生素靶点消失等 [2]。持留菌的形成是一个高度复杂的过程，涉及多个分子和基因表达的上调或下调 [3]，目前，持留菌的形成机制未完全清楚。
随着科学技术的不断发展，各种纳米抗菌材料不断涌现，并在抗菌领域中发挥着重要的作用。在之前的许多研究中，合成了例如金、银、铜等贵金属/合金的纳米材料 [4]，或设计了金属氧化物纳米笼，将其作为药物递送载体，均发现其具有优越的抗菌能力，但也受到有效作用浓度时细胞毒性大，有效抗菌效果时温度较高等副作用的限制，使其无法大规模地投入生产应用 [5] [6]。铂纳米材料优异的生物学特性也引起关注 [7]，铂纳米颗粒对细菌的作用机制可能有以下几种：破坏细胞壁和细胞膜 [8]、诱发DNA损伤 [9]、影响细菌内ATP水平、影响细菌内膜电位、生成活性氧(reactive oxygen species, ROS) [10] 等使得细胞凋亡。
混合价态铂纳米颗粒(dvPtNPs)，由中间零价的铂核Pt(0)和周围二价的铂离子Pt2+组成。在没有光激发的情况下，具有化疗作用的Pt2+离子紧密结合在0价铂核心的表面，dvPtNPs表现出良好的生物相容性。在光线照射下，由于0价铂优良的光热转换能力，产生大量的热并快速释放Pt2+，显示其具有优越的抗肿瘤特性 [11]。在抗菌领域，在NIR的激发下，dvPtNPs可以释放出大量热量和活性氧(ROS)，从而实现了化疗、光热、光动力三种治疗方法的精确同步，具有良好的抗菌效果。本文以持留菌为研究对象，研究了混合价态铂纳米颗粒对持留菌的抗菌效果及其抗菌的机制。
2. 材料与方法
2.1. 材料与设备
2.1.1. 材料
革兰氏阴性菌大肠杆菌(MG1655)、混合价态铂纳米颗粒(dvPtNPs) [12]、AMO2荧光工程菌、ATPsensor荧光工程菌。
2.1.2. 主要设备
莱玻特瑞ZQPW-70全温震荡培养箱；NanoDrop2000紫外-可见分光光度计(Thermo Scientific, USA)；扫描电镜；红外成像仪；红外激发器；Spectramaxi3多功能酶标仪；MolecularDevicesSpectraMaxi3x多功能酶标仪；倒置荧光显微镜Ti2-E (Nikon，日本)。
2.1.3. 主要试剂
LB培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、氨苄西林(国药试剂)、戊二醛试剂、乙醇。
2.2. 研究方法
2.2.1. 持留菌诱导与体外菌落形成单位存活百分比的计算
常规培养革兰氏阴性菌大肠杆菌(MG1655)。将常规传代的MG1655大肠杆菌以1 × 109/ml的细胞数目取4 ml至LB液体培养基，添加150 μg·mL−1的氨苄西林(国药试剂)，在37℃的需氧环境中诱导4 h。诱导4 h后，以8000 r·min−1的转速离心10 min。将液体吸出，并将离心管倒置使残留液体流出。每管使用6 ml磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌。
配好各实验组的材料：PBS组加入磷酸盐缓冲液100 μL；Pt(0)-NP组材料浓度为0.05 mMol·L−1；顺铂组材料浓度为0.1 mMol·L−1；dvPtNPs组材料浓度为0.15 mMol·L−1。每组加入菌液900 μL。每组用PBS将体系补足至1 ml。震荡混匀后，将每个样品在I = 2.96 mA的NIR照射下处理5 min，并在37℃下孵育2 h。然后，将所有样品涡旋并用PBS溶液稀释，并将各组样品取10µL悬浮液铺展在固体培养基上。培养24 h后观察细菌菌落的数量，计算各实验组。存活百分比(%)计算如下：用dvPtNPs治疗的组中的CFU计数/对照组中的CFU计数(PBS组作为对照)。
2.2.2. 扫描电子显微镜(SEM)与RNA泄露的检测
按照常规步骤用材料处理细菌并通过近红外光激发后，37℃温箱孵育2 h，之后8000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入1 mL 2.5%戊二醛，涡旋震散后固定过夜；第二天取固定后的样品8000 rpm离心10 min，弃去上清液；依次加入1 mL 50%、60%、70%、80%、90%、100%的酒精进行梯度脱水，每个浓度15 min；脱水完成后弃去酒精，用管内剩余液体震散细菌，临界点干燥，扫描电镜下观察细菌表面形态。
使用nanodrop2000紫外分光光度计(Thermo Scientific, USA)测量RNA浓度，来评估细菌细胞膜完整性。即有或没有近红外处理的各组在I = 2.96 mA的NIR照射下处理5 min，37℃下孵育2 h后，将样品以8000 rpm离心5 min，收集上清液并测量。
2.2.3. 持留菌膜电位检测
本实验使用AMO2荧光工程菌，该菌内转入了编码mCherry蛋白和arklite蛋白的质粒，mCherry蛋白可产生红色荧光，arklite蛋白可产生绿色荧光。在荧光显微镜下观察时，mCherry蛋白产生的红色荧光为内参荧光，而arklite蛋白产生的绿色荧光为检测持留菌膜电位的指标。用于膜电位检测的细菌在复苏至对数生长期时，加入0.01%的阿拉伯糖来引导AMO2工程菌表达已转录的质粒，其余处理方式如前所述。在经过纳米材料处理后，使用倒置荧光显微镜Ti2-E (Nikon，日本)观察各组持留菌在FITC通道中arklite蛋白发出的绿色荧光及TRITC通道中mCherry蛋白发出的红色荧光，相对荧光强度 = FITC通道绿色荧光强度/TRITC通道红色荧光强度。
2.2.4. 持留菌膜电位检测
本实验使用ATP sensor荧光工程菌，该菌内转入了编码mCherry蛋白和ATP sensor蛋白的质粒，mCherry蛋白可产生红色荧光，ATP sensor蛋白可产生绿色荧光。在荧光显微镜下观察时，mCherry蛋白产生的红色荧光为内参荧光，而ATP sensor蛋白产生的绿色荧光为检测持留菌ATP水平的指标。用于ATP水平检测的细菌在复苏至对数生长期时，加入0.01%的阿拉伯糖来引导ATP sensor工程菌表达已转录的质粒，其余处理方式如前所述。在经过纳米材料处理后，使用倒置荧光显微镜Ti2-E (Nikon，日本)观察各组持留菌在FITC通道中ATP sensor蛋白发出的绿色荧光及TRITC通道中mCherry蛋白发出的红色荧光。
2.3. 体外菌落形成单位存活百分比的统计学分析方法
使用GraphPadPrism8统计软件上的单向方差分析(ANOVA)来测量各组之间的统计学显著性差异(p)。所有数据均表示为平均值±标准偏差。p < 0.05的值被认为具有统计学意义，并使用星号标记(*p < 0.01，**p < 0.001和***p < 0.0001)。
3. 结果与讨论
3.1. 体外菌落形成单位的测量
在经过近红外激光照射处理后，由图1中可观察到，dvPtNPs和Pt(0)-NPs组的与PBS组的菌落数相比，具有显著的统计学差异，说明这些铂材料都具有良好的杀菌活性，其中dvPtNPs的杀菌效率达到了80%以上。此外，dvPtNPs组与Pt(0)-NPs组的杀菌效率相比，也有统计学差异，说明dvPtNPs的杀菌活性更优。虽然顺铂组的杀菌效率明显大于dvPtNPs，但因顺铂较强的副作用及不良反应，相比之下混合价态铂纳米颗粒仍具有较好的发展前景。
(A.各铂纳米材料及顺铂处理过的体外菌落形成单位的照片；B.各铂纳米材料及顺铂处理过的体外菌落形成单位存活百分比的统计学分析结果，激光功率密度(808 nm)为1.5 W cm−2)
Figure 1. Photos and quantitative analysis of bacterial colony of Pt NPs and cisplatin in vitro
图1. 各铂纳米材料及顺铂处理过的体外菌落形成单位的照片及定量分析(n = 3)
3.2. 扫描电子显微镜及RNA 泄露的检测
具有光热作用的铂纳米颗粒可以使细菌壁膜结构的完整性造成破坏，导致细菌丧失正常的表面形态，变得无定形、干瘪，并且当细菌细胞膜发生破坏时，细胞内容物就会外流，最终导致细菌死亡。为探究具体机制，我们使用扫描电镜观察持留菌在经过包括dvPtNPs在内的铂纳米颗粒处理后表面形态的变化，并通过细菌RNA泄露实验来确认细胞内容物外流现象。图2显示，在未光照组中，对照组、Pt(0)-NPs组以及dvPtNPs组中细菌表面形态无明显异常，而在顺铂组中出现了丝状变化的大肠杆菌，这是顺铂损伤细菌DNA的标志。
(最左侧两组均为dvPtNPs组在不同视野下的SEM观测结果)
Figure 2. SEM images of bacteria incubated with dvPtNPs, other Pt NPs, and cisplatin
图2. 各组铂纳米材料处理过的细菌SEM观测结果(红色箭头为细菌表面穿孔、凹陷；黄色箭头为丝状变化的细菌)
在光照组中，Pt(0)-NPs组由于其良好的光热效应，导致细菌表面结构破坏，出现多处凹陷、穿孔；顺铂组则与不光照时结果相似，在顺铂的化学DNA损伤作用下，出现了丝状变化的细菌。而且，dvPtNPs组的细菌同时出现了表面凹陷穿孔和丝状变化两种异常情况，这表明dvPtNPs在近红外光激发下能够同时造成细菌表面穿孔以及DNA损伤。从dvPtNPs释放的Pt2+离子会像顺铂一样造成DNA损伤，验证了混合价态铂纳米颗粒的光热效应和光化学杀菌的协同作用。同时图3显示，当未受到近红外光的激发时，所有组细菌上清中RNA的含量无明显差别。当受到近红外光的激发时，Pt(0)-NPs和dvPtNPs组上清中RNA的含量与PBS组的有显著差异。而Pt(0)-NPs和dvPtNPs组之间上清中RNA的浓度无显著差别，说明这两组细菌细胞膜破坏程度类似。这与SEM观察结果一致，说明dvPtNPs的抗菌作用与Pt(0)-NPs相同，与细菌膜的损伤有关。
Figure 3. RNA concentration released from bacteria incubated with dvPtNPs, other Pt NPs, and cisplatin (n = 3)
图3. 各组铂纳米材料及顺铂处理过的细菌RNA泄露检测(n = 3)
3.3. 持留菌膜电位检测
为测定铂纳米材料对于细菌膜电位的影响，我们选用荧光工程菌AMO2，以mCherry蛋白在TRITC通道发出的红色荧光作为内参，以膜电位蛋白arklite蛋白在FITC通道发出的绿色荧光作为细菌膜电位的标志，使用相对荧光强度(绿色荧光强度/红色荧光强度)来表征细菌膜电位。从图4可以得知，在无近红外光激发的情况下，PBS组的arklite蛋白在FITC通道发出较强的绿色荧光，将其与mCherry在TRITC通道发出的红色荧光合并后，整体可观察到较明显的青色荧光，其相对荧光值约为0.5485。在受到Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs、dvPtNPs以及顺铂的处理后，arklite蛋白发出绿色荧光荧光强度减弱，这几组合并通道后形成的细菌图整体呈现出青黄色。
(A.各组持留菌不受到和受到近红外激发时膜电位的荧光图，FITC通道为arklite蛋白，TRITC通道为mCherry蛋白；B.C.各组持留菌不受到和受到近红外激发时膜电位的相对荧光值分析；比例尺为20 μm)
Figure 4. Membrane potential detection of bacteria incubated with dvPtNPs, other Pt NPs, and cisplatin
图4. 各组铂纳米材料及顺铂处理过的膜电位检测
从图4(B)中也可得知，与PBS组相比，Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs和dvPtNPs组的相对荧光强度显著下降，说明了只要是加入了铂纳米材料或是顺铂，都会引起持留菌膜电位的降低。其中，Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs和dvPtNPs对持留菌膜电位的影响无显著差异，其相对荧光值分别约为0.4551、0.4634和0.5033，而顺铂对膜电位的影响相比于各铂纳米材料组要明显。当各处理组受到近红外光的照射后，Pt(0)-NPs、Pt(0)-Pt(II)-NPs和dvPtNPs的arklite荧光强度显著下降，细菌在红绿通道合成荧光图呈明显的红点。如图4(C)所示，Pt(0)-NPs和dvPtNPs的相对荧光强度在近红外激发后显著下降，其值分别为0.3524和0.2722。而Pt(II)-NPs组和顺铂组的相对荧光值在近红外光激发前后并无显著差异。
3.4. 持留菌ATP水平的测量
为了探究dvPtNPs对持留菌体内ATP水平的影响，我们使用荧光工程菌ATPSensor进行实验，以mCherry蛋白在TRITC通道发出的红色荧光作为内参，以ATPSensor蛋白在FITC通道发出的绿色荧光为ATP水平的表征，用相对荧光强度分析持留菌经过不同处理后的ATP水平。从图5我们可以得知，在无近红外光激发的情况下，PBS、Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs和dvPtNPs组的ATP感应蛋白在FITC通道发出较强的绿色荧光，混合通道(Merge)中可观察到散发青色荧光的持留菌。
如图5(B)所示，持留菌在受到Pt(0)-NPs、Pt(II)-NPs和dvPtNPs的处理后，其相对荧光值分别为0.5915、0.5931和0.5909，与PBS组的无显著差别，说明加入各组铂材料后对持留菌的ATP水平无明显影响。与此相反，顺铂组的合成通道图中可观察到发红光和黄光的持留菌。通过图5(B)的数据中可知，即使无近红外光激发，顺铂组的持留菌ATP水平相比于PBS组的明显下降。当各组持留菌受到近红外光激发后，与PBS组相比，Pt(0)-NPs和dvPtNPs组的混合通道中持留菌的荧光颜色由青色转变为黄色和红色。通过图C的数据中可知，近红外光照射后，Pt(0)-NPs和dvPtNPs组的相对荧光强度显著下降，说明铂纳米材料的光热作用对持留菌的能量代谢具有较大的影响。其中，dvPtNPs组的ATP水平相比于Pt(0)-NPs和Pt(0)-Pt(II)-NPs的更低。而Pt(II)-NPs组和顺铂组的相对荧光值在近红外光激发前后并无显著差异，说明Pt(II)-NPs和顺铂无近红外响应性。
(A. 各组持留菌不受到和受到近红外激发时ATP的荧光图，FITC通道为ATP Sensor蛋白，TRITC通道为mCherry蛋白；B. C. 各组持留菌不受到和受到近红外激发时膜电位的相对荧光值分析；比例尺为20 μm)
Figure 5. ATP detection of bacteria incubated with dvPtNPs, other Pt NPs, and cisplatin
图5. 各组铂纳米材料及顺铂处理过的ATP检测
4. 讨论
已经报道混合价态铂纳米颗粒(dvPtNPs)在近红外激光的照射下可以有效诱导革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的快速死亡和长期抑制，发挥化疗作用、光热作用和光动力作用 [12]。在没有光激发的情况下，具有化疗作用的Pt2+离子紧密结合在0价铂核心的表面，dvPtNPs表现出良好的生物相容性。暴露在NIR的照射下，由于0价铂优良的光热转换能力，Pt2+离子和0价铂之间的金属键断裂，Pt2+离子大量释放，同时dvPtNPs可以产生大量热量和活性氧(ROS)，从而实现化疗、光热和光动力三种治疗方法的精确同步。本研究使用由革兰氏阴性菌诱导得到的持留菌进行相关研究，发现其对持留菌同样具有十分有效的杀伤作用。
此外，本研究进一步验证了混合价态铂纳米颗粒对持留菌的杀伤效果并探索杀伤机制。首先，利用扫描电子显微镜(SEM)能观察不同处理后细菌的形态，金属Ag、Au和Pt可导致其表面的非晶态和干枯样改变 [8]。在本研究中观察细菌的表面形态改变，也可在细菌的表面可以观察到皱缩和空洞。一旦细胞膜的完整性被破坏，细胞内部的DNA或者RNA等成分就会逸出 [13] [14]。本研究进行了RNA泄露检测实验，发现经过光照处理过后，Pt(0)-NPs和dvPtNPs组的RNA浓度显著升高，而其他组与对照组保持基线水平。扫描电子显微镜(SEM)结果中还发现一些细丝状的细菌，这是DNA损伤的标志 [15] [16]，表明从dvPtNPs释放的Pt2+离子会像顺铂一样产生DNA损伤。因此，dvPtNPs在经过近红外激光NIR处理后可以导致持留菌的细胞膜穿孔和RNA泄露。抗菌药物也可以通过影响细菌膜电位，干扰细菌代谢，信息传递来达到杀菌的目的 [17] [18]。本实验中加入铂纳米材料和顺铂后都可以引起持留菌膜电位的降低，而在近红外激光处理之后dvPtNP组的持留菌膜电位显著下降。金属纳米颗粒会灭活对ATP合成至关重要的酶和蛋白，降低ATP的浓度，经过近红外光激发的dvPtNPs会降低普通细菌的ATP水平。但也有文献指出 [19] [20]，金铂纳米颗粒(AuPtNPs)会导致细菌体内ATP水平升高，这是由于纳米颗粒抑制了蛋白质合成等消耗ATP的生化反应。本实验检测了dvPtNPs对微生物ATP代谢的影响，顺铂组和NIR处理后的dvPtNPs组的ATP水平呈现出下降趋势，说明混合价态铂纳米颗粒对于持留菌的能量代谢有较大影响。
总之，混合价态铂纳米颗粒对持留菌也表现出了多模式抗菌作用，包括化疗、光热和光动力作用，通过破坏细胞完整性、代谢紊乱和DNA损伤等机制抗微生物。这种多模式精准同步治疗已经成为抗肿瘤、抗感染领域的趋势，其有望成为对抗持留菌感染的新型治疗方法。
5. 结论
持留菌的存在是临床感染迁延不愈的重要原因之一，基于混合价态铂纳米颗粒(dvPtNPs)对普通细菌的良好杀伤效果、低生物毒性、多种机制联合性以及光动力可控治疗等优点，本项目旨在进一步探究dvPtNPs对持留菌的杀伤效果，并结合持留菌形成和产生耐药性的机制，深入研究dvPtNPs对持留菌的杀伤原理，从而为持留菌的清除提供一种新的材料，为多种慢性感染性疾病的临床治疗提供新的思路，改善慢性迁延不愈感染难以治愈的现状，以期提高患者的生活质量。
基金项目
国家自然科学基金委会青年科学基金项目“近红外响应的卟啉银聚合物应用于牙周炎抗菌治疗及机制研究”(项目批准号：82101021)；省级大学生创新创业训练计划项目“混合价态铂纳米颗粒对持留菌作用的探索”(项目编号：S2020304001)。