基于BSA混池测序分析开发胡杨性别鉴定的标记

A Novel Method for Gender Identification of Populus euphratica Oliv. Based BSA Mixed Pool Sequencing Analysis

摘要: 胡杨是中国西北地区重要的乔木树种，其在新疆的分布最为广泛，具有较强的耐旱、耐寒、抗盐碱的能力，在遏制沙漠扩展、保护生物多样性、保障工农业生产生态安全等诸多方面具有不可替代的作用。为了能够在胡杨幼苗阶段对雌雄个体进行性别鉴定，本研究提取雌雄胡杨叶片高质量的基因组DNA，分别构建文库以进行Illumina、PacBio和Hi-C测序。基于PacBio测序得到的reads进行初步组装。并采用Illumina测序得到的reads对组装结果进行纠错得到草图版本的基因组。利用Hi-C测序技术将雌雄基因组组装，对雌雄基因组进行注释、评估，获得到染色体水平的高质量雌雄基因组序列。基于BSA混池测序分析，以胡杨雄株高质量基因组为参考，对96个雌株和97个雄株的BSA-seq数据进行关联分析，筛选出雌性混池深度连续为0，同时雄性混池深度连续大于10的区域。对这些区域提取包括上下游150 bp在内的序列作为性别鉴定候选区域，将性别候选区域与胡杨高质量雌株基因组进行Blast同源比对，根据性别候选区最终筛选出胡杨雌雄共有的3对特异性引物和雄性性别连锁的4对特异性引物。结果表明胡杨待测样品在雌雄共有引物对扩增出条带的基础上，若扩增出100~300 bp大小的特有条带则为雄性，若未扩增出目标条带，则为雌性。这为在幼苗期对胡杨性别进行鉴定提供了重要的理论依据，为解决行道树旁胡杨飞絮污染问题和商业化种植与应用提供了可靠的解决方案。

Abstract: Populus euphratica is an important tree species in northwest China, among which Xinjiang is the most widely distributed, with strong drought, cold, and salinity resistance. It plays an irreplacea-ble role in many aspects such as curbing the expansion of deserts, protecting biodiversity, and ensuring the ecological security of industrial and agricultural production. To enable sex identifi-cation of male and female individuals at the seedling stage of P. euphratica, high-quality genomic DNA from male and female P. euphratica leaves was extracted, and libraries were constructed for Illumina, PacBio, and Hi-C sequencing. Preliminary assembly was performed based on the reads obtained by PacBio sequencing, and the reads obtained by Illumina sequencing were used to correct the assembly results to obtain a draft version of the genome. The male and female genomes were assembled by Hi-C sequencing technology, and the male and female genomes were annotated and evaluated to obtain high-quality male and female genome sequences at the chromosome level. Taking the assembled male genome as a reference, the BSA-seq data of 96 female plants and 97 male plants were subjected to association analysis using the BSA mixed pools. The candidate sequences of sex identification are where the depth of the female pool was continuously 0, while the depth of the male pool was continuously greater than 10 was obtained. Sequences including upstream and downstream 150 bp were extracted from these regions as candidate gender markers. Blast the candidate sequences to the assembled female genome. Finally, three pairs of specific primers shared by male and female and four pairs of specific primers linked by male sex were designed according to the screened sex candidate sequences. The results show that, On the basis of amplifying the bands from the male and female common markers, if a 100~300 bp male-specific marker band is amplified, it will be a male; if the target band is not amplified by the primer pair of the male marker, it will be a female. These provide an important theoretical basis for the sex identification mechanism of P. euphratica in the seedling stage, and provide a solution for solving the pollution problem of flying fuzz seeds near street trees and commercial planting and application.

1. 引言

胡杨(Populus euphratica Oliv.)别名胡桐、异叶杨，是古地中海残遗植物种 [1]，被称为“第三世纪活化石”。胡杨的世界分布范围横跨亚、非、欧三个大陆，主要分布在中亚、西亚，其次是北非和南欧 [2]。胡杨的中国分布在北纬37˚~47˚ (特别集中在37˚~42˚)，从天山南北向东经罗布泊低地和哈密嘎顺戈壁至甘肃河西走廊西端敦煌以及内蒙古，形成东西走向的狭长、曲折、断续的廊状林地，主要分布在新疆塔里木盆地和准格尔盆地 [3]。胡杨为雌雄异株植物，具有根孽繁殖能力强、个体相对集中、群体相对分散、雌雄异步开始，近同期结束的特性 [4]，为抵御在开花期出现不利自然条件，避免胡杨、灰杨授粉中断创造了有利的条件，体现了胡杨群体适应荒漠化环境所采取的一种生殖策略 [5]。胡杨因其能够适应干旱荒漠区恶劣的自然环境，市场上对胡杨苗木的需求在逐年增加，然而胡杨种子实生苗性状分离严重、成材困难，难以满足市场需求 [6]，因此在幼苗期能够鉴定出胡杨性别对于市场需求或者生态效益而言都是至关重要的。

植物性别的表现形式较为复杂，在植株水平上，可分为雌雄同株同花、雌雄异株、雌雄异花同株、雌花两性花同株、雄花两性花同株 [7] [8]。雌雄异株植物因其不同性别具有不同的植株表型，因此在人类的生产实践活动中具有极其中重要的价值，例如当以获取农作物种子和果实为目的栽培时，则需要大量的雌花或者雌性植株，如黄瓜(Cucumis sativus L.)作为蔬菜，人们在实际生产中往往通过激素处理诱导雌花的分化，以获取更多果实；在获取番木瓜(Carica papaya L.)和银杏(Ginkgo biloba L.)的果实时 [9] [10]，生产者往往需要在幼苗期对其性别进行早期鉴定，来调节其种植比例以达到最大的经济效益；以道路绿化景观设计为目的时，雄株银杏长势旺盛，在栽培中应以雄株为佳 [10]；大麻(Cannabis sativa L.)的雄株纤维质量更优 [11]，因此在实际的生产栽培中也以雄株大麻的需求为主。总的来说，雌雄异株植物在形态学以及经济价值方面都存在一定差异，有针对性的对植物性别进行鉴定有利于满足实际生产需求 [12]。

植物性别决定机制是一个错综复杂的调控过程，由于其易受营养状况、水分、光照、温度、激素等环境因子的影响，因此植物的性别决定机制往往比动物更为复杂 [13]。前人对于植物性别鉴定的研究方法主要集中在分析雌雄株外部形态、生理代谢产物、同工酶、核苷酸序列差异等方面 [14]。DNA分子标记因其具有准确度高、重复性好、受环境影响小等优势，已被广泛应用于雌雄异株植物的早期性别鉴定中 [15]。当前，雌雄异株植物早期性别鉴定的分子标记技术主要有RAPD标记 [10] [16] [17]、SCAR标记 [18]、AFLP标记 [19]。ISSR标记因其揭示物种的多态性高，已应用于基因定位 [20]、遗传作图 [21]、种质资源鉴定 [22]、进化和系统发育 [23] 方面，而ISSR标记在植物性别鉴定中的应用中也尚未见报道。由Michlmore等人首次提出的BSA混池分组分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)，是指对所研究的表型性状，选择表型差异显著的亲本构建表型分离群体，在分离群体中选择极端表型的一定数量的个体，分别混合构建DNA池，比较不同表型DNA池之间基因突变频率的差异，存在差异的区段即为目的基因或数量性状位点(Quantitative Trait Locus, QTL)所在的染色体候选位置，对锁定到的候选区间内的基因进行功能注释，实现性状决定基因的快速定位。例如早期应用于干旱胁迫下的水稻产量 [24]、耐旱性 [25] [26] [27] 和耐热性 [28]、小麦的水分胁迫 [29] 和埃及棉的耐盐性 [30] 等方面的研究。随着新一代测序技术的迅猛发展，人们提出了BSA混池测序分析的方法，即对样本进行BSA混池分组分析的基础上，对极端性状分别构成的混合池进行下一代测序(next-generation sequencing, NGS)，辅助高通量基因分型，从而达到能够快速、准确识别性状决定基因，显著降低研究成本的新策略。例如Yang等 [31] 从10800个样本量中挑出对低温极端敏感430株对和对极端耐受低温的385株水稻幼苗，对大约45万个SNP进行基因分型，最终获得6个低温QTL，也鉴定出4个部分抗稻瘟病QTL和2个苗木活力QTL。Song等 [32] 在大豆中鉴定出控制种子子叶黄色和绿色颜色的两个定性基因，结果表明，即使一个性状受多个基因座控制，BSA-seq也可以加速控制定性性状的基因定位。

胡杨作为荒漠地区特有的珍贵乔木树种，它具有耐寒、耐旱、耐盐碱、抗风沙，有很强的生命力等特性，特别是叶形多变、叶色美丽，是新疆当地行道树中首选的树种。胡杨的雌株在果实成熟期散布大量带冠毛的种子，这些带冠毛的种子随风飘扬，给人们生活出行带来了许多不便，因此在行道绿化建设中急需要选择胡杨的雄株，但是胡杨幼苗阶段雌雄在形态上无差异、难以辨别。本研究基于城市绿化建设中的需求，拟从分子水平，采用BSA混池测序分析方法，探究胡杨雌雄株中与性别连锁的特异性引物条带，为胡杨在幼苗期间性别鉴定提供理论依据，为后期大规模种植及其他杨树的性别鉴定提供技术支撑。

2. 材料和方法

2.1. 样品的采集及DNA提取

基于本课题组分别对96个雌株和97个雄株样本DNA的混池测序数据分析(BIG-GSA nos. CRR330932和CRR330933)，同时在2020年7月份，从不同地区采集带有果实的胡杨雌树10株和无果实的雄树10株(表1)，采集标准为胡杨叶片无明显的病虫害侵染，带回实验室进行DNA提取。

Table 1. Sampling sites of different dioecious populus euphratica individuals

表1. 不同胡杨雌雄株的采样地点

2.2. 引物设计

以雄基因组(GWH accession ID: GWHBHOO00000000)为参考，以本课题组研究的96个雌株和97个雄株的BSA-seq数据进行关联分析，得到雌性混池深度连续为0，同时雄性混池深度连续大于10的区域。对这些区域提取包括上下游150 bp在内的序列作为候选的性别标记。对所得标记与组装所得雌株基因组(GWH accession ID: GWHBHNV00000000)进行Blast比对序列比对，初步将得到的30个候选标记，采用Primer 5软件以30个候选性别标记为目的片段设计引物，其中引物长度为18~22 bp，GC含量为35%~48%。随后将设计的引物送公司进行合成，引物具体分为雌雄共有标记16个，雌雄可能共有标记10个，以及雄性特有标记4个。

2.3. PCR体系的构建

利用合成的30对引物对胡杨雌雄各10个样品提取的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系如下(表2)。PCR的产物取5 μL，采用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在80 Ｖ稳压下电泳30 min，电泳完毕后，通过凝胶成像系统进行拍照并记录结果。分别找出在胡杨雌雄株各10个样品中均能扩增出明亮、清晰的目的条带以及仅能在雄株10个样品中均能扩增出的引物对。

Table 2. PCR reaction system

表2. PCR反应体系

3. 结果与分析

3.1. 雌雄共有标记的开发与检测

利用胡杨雌雄株共有标记的16对引物，以不同地区胡杨群体待测雌雄株各10个样品提取的DNA为模板，进行PCR扩增实验。最终从预先设计的16对引物中，发现能够准确扩增出清晰、明亮条带的3对候选核心引物，其分别对应的图(图1)和对应的引物序列如下(表3)，结果表明候选的这三对引物(F1, F2, F3)中的任意一对，都能够有效的检测出是否从待测雌雄株样品中提取出胡杨DNA样品。

Table 3. Specific primer sequences shared by dioecious populus euphratica

表3. 胡杨雌雄株共有的特异性引物序列

3.2. 雄性特有标记的开发与检测

利用胡杨雌雄株可能共有的10对引物及雄性特有的4对引物共14对引物，以不同地区群体待测胡杨雌雄株各10个样品提取的DNA为模板，进行PCR扩增实验。最终从预先设计的14对引物中，发现能够准确扩增出具有清晰、明亮条带的4对雄性特异性核心引物，其分别对应的图(图2)和对应的引物序列如下(表4)。结果表明，在雌雄共有标记扩增出条带的基础上，若扩增出100~300 bp大小的雄性特有标记的条带，则为雄性；若雄性标记的引物对未扩增出目标条带，则为雌性。

Figure 1. Amplification profile of 20 untested populus euphratica samples in three pairs of primers shared by females and males

图1. 20个胡杨待测雌雄株样品在三对雌雄共有性引物中的扩增谱

Figure 2. Amplification profile of 20 untested samples in four pairs of male-sex primers shared by populus euphratica

图2. 20个胡杨待测雌雄株样品在四对雄性特有性引物中的扩增谱

Table 4. Primers sequences for male-specific markers of populus euphratica

表4. 胡杨雄性特异性标记的引物序列

4. 讨论

杨属在世界的分布范围广、木材应用广，仅中国的面积就已超过7 × 10⁶ hm²，为研究杨树物种性别决定提供了丰富的材料来源 [33]，杨属物种多为雌雄异株植物，其中胡杨群体在中国主要分布于西北地区，对维系极端干旱区生态平衡具有重要的生态价值。尽管胡杨的二代基因组测序 [34] 及其他杨属的基因组测序已经基本完成，然而对于杨属物种的雌雄性别鉴定报道却少之又少，当前有关杨属报道的是银白杨早期性别鉴定的雌性特异的两个DNA分子标记，但尚未见有关胡杨性别鉴定相关分子标记的开发和应用。因此本研究利用BSA混池测序分析96个雌株和97个雄株样本，开发出3对雌雄共有的核心引物及4对雄性特异性引物，该方法有助于快速且经济高效地鉴定胡杨的性别，也有助于进一步对胡杨性别决定的分子机制和繁殖机制的研究。

相比于传统胡杨性别的识别方法，分子水平上胡杨性别鉴定的准确度更高，例如通过解剖学方法对胡杨雌雄株叶片进行分析，发现胡杨雌株叶片的表皮细胞厚度、角质层厚度、叶片厚度等均明显大雄株，且雌株叶片旱生结构特点更明显 [35]。同时对胡杨雌雄株叶片气孔的差异进行比较，发现雌株下表皮气孔密度显著高于雄株，雌株上表皮气孔长度显著长于雄株气孔长等结果 [36]。然而研究表型性状的群体数量有限、人为观察测量误差大、物种的表型性状易受不同种源地环境因子的影响而发生可塑性变化 [37]，更为重要的是研究的对象一般为胡杨成熟阶段的表型性状，而非胡杨的幼苗阶段，这些因素对辨别胡杨群体雌雄株带来了很大的困难。而在分子水平上，因不受个体发育时期以及取材部位的限制，不用考虑环境因素以及基因表达与否等因素，因此在本研究中，利用分子手段从基因组水平上来对胡杨雌雄群体早期发育阶段进行鉴定显得更为准确和重要。

近年来RAPD分子标记因其在不同物种中含有丰富的多态位点信息，而被广泛用于雌雄异株植物的性别早期鉴定中 [16] [17]。然而RAPD技术需要严格标准化PCR条件，因为不同浓度的DNA聚合酶、DNA模板和引物比例或退火温度会导致扩增结果的差异，从而导致指纹的重复性低 [38]，例如Sharma等 [39] 利用RAPD分子标记获得与沙棘雄性特异性基因连锁OPD20-911标记基因，然而它仅限于鉴定五种雄蕊和雌蕊基因型。因此RAPD分子标记对于植物的鉴定性别并不具有广泛的可靠性和稳定性，RAPD分子标记也逐渐转向为更稳定的SCAR标记。Korekar等 [40] 分别从沙棘雌雄混池样本中筛选出60对RAPD引物，最终确定了两个与雌性连锁的SCAR标记。Jiang等 [41] 在芦笋(Asparagus officinalis L.)的混池样本中，利用RAPD标记获得的760对引物进行用于批量分离分析，最终获得1个与雄性连锁的SCAR标记。当然SCAR标记也存在一定的缺陷，例如待测样品的DNA降解，则会引起目的片段的PCP扩增失败，导致植物性别鉴定结果错误，然而在本实验研究中，首先用雌雄共有的3对特异性引物中的任意一对来检验不同地区群体胡杨样品是否存在提取的DNA降解或者成功提取，其次用4对与胡杨雄性别连锁的特异性引物中任意一对来鉴定待测胡杨样品的雌雄性别，同时本研究的优势是用极少的引物却可以获得较多的性别连锁的特异性标记。因此本实验研究方法很好地克服了RAPD标记中的结果不稳定和SCAR标记中需要设计大量的引物进行筛选的繁琐程序和防止DNA降解的等缺点。

5. 结论

本研究在分子水平上，分别对胡杨雌雄株的DNA混合样本进行BSA混池测序分析，最终获得了与胡杨雄株性别连锁的特有引物条带，成功解决了胡杨幼苗阶段雌雄性别鉴定难这一问题，为后期在荒漠区大规模种植胡杨幼苗及其他杨树的性别鉴定提供了技术上的支撑和理论上的指导。

致谢

感谢盖中帅、孙健皓、邱晨、郭雪飞、李秀、董晓山、王子健、王佳宁、张晋龙、杨宇琦等同学在采样过程中的协助。

基金项目

兵团财政科技计划资助(2022CB001-10)，塔里木大学校长基金自然科学项目(TDZKKY202202)，塔里木大学研究生科研创新项目(TDGRI201901, XJ2021G292)资助。

NOTES

^#第一作者。

^*通讯作者。