1. 引言
近年来,乳腺癌的发病率逐渐上升 [1],其治疗仍主要采用手术、化疗、放疗等传统手段。然而这些传统的治疗方法虽然能取得良好的治疗效果,但也存在许多不可避免的缺点,如选择性差、全身毒性高、易产生耐药性、容易复发和转移等 [2]。因此,探索新的肿瘤治疗方法,采用协同治疗是未来肿瘤治疗的新方向。光热治疗(PTT)是一种在肿瘤组织中聚集光热转化剂的新型治疗方法,光热转化剂在外部光源的照射下,吸收光能,产生能量转换,将光能转化成热能,使其局部温度升高,从而杀死癌细胞或组织 [3]。PTT作为一种无创治疗方法,因其毒性低、副作用少而受到越来越多学者的关注。
目前,二维(2D)纳米材料,包括石墨烯 [4]、锑烯 [5]、黑鳞 [6]、二卤代物和氧化物 [7]。因其具有超薄的片层结构、丰富的表面功能、较大的比表面积和较低的生物毒性,在生物医学领域得到广泛研究。除上述材料外,MXene作为一种新型的2D纳米材料,也引起了科学界的广泛兴趣 [8] [9]。对于公式为Mn+1XnTx (n = 1~3)的材料,通常由过渡金属(M)和碳/氮(X)组成,并由它们所对应的MAX相生成。A代表元素周期表中IIIA或者IVA族的元素,Tx代表它们的表面官能团,如-O、-OH、和-F,这取决于所选用的刻蚀剂。与传统的2D纳米材料相比,MXene在生物医学应用中具有以下几个优点:1) 丰富的表面官能团使其具有良好的亲水性,解决了大多数化疗药物疏水性的缺点 [10];2) 具有极低的细胞毒性和良好的生物组织相容性 [11] [12];3) 巨大的活性表面,可连载化疗药物进行协同化疗,或与靶向分子连接进行靶向治疗 [13];4) 具有较高的近红外光吸收性能和光热转化效率 [14]。这些特性使得MXene不仅是一种良好的光热转化剂,同时也是一种理想的抗癌药物传递载体,以配合化疗达到更好的治疗效果。
在本研究中,通过原位生长的方法将Au NPs固定在Ti3C2表面,引入巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO)增加载体水溶性,同时负载化疗药物阿霉素(DOX),构建DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合体系,探究其体内外光热转化性能和抗乳腺癌作用,为肿瘤治疗提供新的研究思路。
2. 实验部分
2.1. 实验材料
盐酸,氟化锂,氯金酸,国药集团化学试剂有限公司;巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO,分子量5000),西安齐岳生物有限公司;四羟甲基氯化磷(THPC, 80%),聚丙烯胺盐酸盐(PAH,分子量15,000),上海阿拉丁生化科技有限公司;阿霉素(DOX),大连美仑生物科技有限公司;CCK-8试剂盒,MedChemExpress;RPMI-1640培养基,胎牛血清(FBS),美国GIBCO公司。
2.2. DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合递药体系的制备
首先,用盐酸/氟化锂刻蚀掉最大相Ti3AlC2中的Al层,合成Ti3C2纳米薄片。将1 g氟化锂加入到20 mL 9 M盐酸溶液中搅拌5 min使氟化锂完全溶解,然后将1 g Ti3AlC2逐渐加入上述溶液,35℃环境中反应24 h。多次离心、洗涤至上清液pH达到6时,得到Ti3C2纳米薄片。
然后,制备金种子和金生长溶液,并采用原位生长的方法将Au NPs固定在Ti3C2纳米片表面。将12 µL四羟甲基氯化磷(THPC, 80%)和0.25 mL氢氧化钠(2 M)溶液加入到45 mL超纯水中搅拌5 min,将2 mL氯金酸溶液(1%)快速加入上述溶液中,室温下避光搅拌过夜,得到金种子溶液。将25 mg碳酸钾加入到含有1.5 mL氯金酸的100 mL超纯水中,室温下避光搅拌过夜,得到金生长溶液。将2 mL Ti3C2纳米片悬液(1 mg∙mL−1)加入到4 mL 2 mg∙mL−1的聚丙烯胺盐酸盐(PAH,分子量15,000)溶液中充分反应,离心洗涤去除多余PAH分子后,加入10 mL金种子溶液,室温搅拌4 h,离心洗涤去除多余金种子溶液后,加入金生长溶液搅拌2 h,加入29%甲醛溶液搅拌1 h,即得到含Ti3C2@Au的悬液。
最终,制备DOX@Ti3C2@Au-PEG纳米复合递药体系。将1 mL Ti3C2@Au (1 mg∙mL−1)悬液分散在4 mL巯基聚乙二醇醛基(SH-PEG-CHO, 4 mg∙mL−1)溶液中搅拌2 h,加入20 mL 10 µg∙mL−1 DOX溶液,室温下避光搅拌过夜,将沉淀物收集为DOX@Ti3C2@Au-PEG,冷冻干燥后,置于−20℃储存以备后续使用。
2.3. 表征
使用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察Ti3C2纳米片和Ti3C2@Au纳米复合材料的形貌,使用红外热成像仪记录实验中的温度变化。
2.4. 体外光热转化性能研究
将Ti3C2@Au悬液(0.05 mg∙mL−1)用808 nm、0.75 W cm-2的激光照射10 min,观察其温度变化情况,并与水溶液作对照。Ti3C2@Au悬液(0.1 mg∙mL−1)分别经808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm−2)激光照射5 min,研究其光热升温性能。
2.5. 细胞实验
2.5.1. 细胞培养
小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞由青岛大学附属医院中心实验室提供。使用含有90% RPMI-1640基础培养基、10% FBS和1%青霉素/链霉素双抗溶液的完全培养基进行培养,置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱中孵育。
2.5.2. 体外DOX@Ti3C2@Au-PEG抗乳腺癌研究
为研究Ti3C2@Au-PEG纳米复合载体的细胞毒性,首先将4T1细胞以8 × 103/孔的密度接种于96孔板中,完全培养基孵育过夜,使细胞贴壁,加入不同浓度的Ti3C2@Au-PEG悬液(0、150、300、450、600 ppm)孵育24 h,每个浓度设五个复孔,孵育结束后,使用CCK-8试剂盒检测细胞相对存活率。为研究不同浓度Ti3C2@Au-PEG悬液经NIR照射的细胞杀伤作用,将同样孵育过夜的贴壁细胞,分别与不同浓度Ti3C2@Au-PEG悬液(0、25、50、75、100 ppm)孵育4 h,用808 nm、0.75 W∙cm−2的激光照射5 min,使用CCK-8试剂盒检测细胞相对存活率。
将4T1细胞以8 × 103/孔的密度接种于96孔板中,完全培养基孵育过夜,使细胞贴壁。如表1所示,分五组进行实验,各组处理结束后,使用Calcein/PI双染试剂盒进行细胞染色,活细胞被染成绿色,死细胞被染成红色。每组设五个复孔,重复三次实验。
2.6. 统计学分析
使用SPSS26.0软件进行统计学分析。定量资料以均数 ± 标准差(Means ± SD)表示,两组间均数数比较采用两独立样本t检验(independent samples t-test),P < 0.05认为差异具有统计学意义。
3. 结果与讨论
3.1. 基于Au NPs修饰Ti3C2的纳米复合载体的表征
为了证实单层Ti3C2和Ti3C2@Au纳米复合材料的成功制备,对其进行了SEM表征,如图1(a)、图1(b)所示,合成的Ti3C2表面干净,略有卷曲,Au NPs均匀地散在分布在Ti3C2纳米片表面,出现几条褶皱,说明其具有良好的柔韧性,SEM图像直接证实了Ti3C2和Ti3C2@Au的成功制备。
TEM图像(图2(a),图2(b))所得结果与SEM图像相对应,可以更加清晰地看到Ti3C2纳米片的形貌,已经被完全刻蚀呈薄层状,另外,Au NPs在其表面的均匀分布,粒径在5~30 nm之间,这样相对较小的纳米粒径,为后续体内有效循环提供了可能性。
另外,Ti3C2@Au纳米复合材料的能量色散分析表(表2)显示了其主要元素组成:C (51.62%)、Ti (1.76%)、Au (8.81%),其中Al层已经从MAX相中被完全刻蚀掉,说明Ti3C2的成功制备以及Au NPs的良好表面固定。
(a) (b)
Figure 1. The SEM images of Ti3C2 (a) and Ti3C2@Au (b)
图1. Ti3C2 (a) 和Ti3C2@Au (b) 的扫描电子显微镜(SEM)图像
(a) (b)
Figure 2. The TEM images of Ti3C2 (a) and Ti3C2@Au (b)
图2. Ti3C2 (a) 和Ti3C2@Au (b) 的透射电子显微镜(TEM)图像
Table 2. Main element composition of Ti3C2@Au nanocomposites
表2. Ti3C2@Au纳米复合材料的主要元素组成
3.2. 体外光热转化性能研究
用808 nm、0.75 W∙cm−2的激光照射Ti3C2@Au悬液(0.05 mg∙mL−1) 10 min,其温度可以达到49.4℃,而相同条件下,水溶液仅能达到36.5℃(图3(a)),二者之间存在显著统计学差异(P < 0.01)。Au NP作为一种贵金属,本身具有很好的光热升温性能,与纳米材料结合在一起,进一步提高了整个载体的光热转化效率。另外,用808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm−2)的NIR照射Ti3C2@Au悬液(0.1 mg∙mL−1) 5 min,结果如图3(b)所示,随着功率的增加,Ti3C2@Au悬液的温度逐渐升高,且各组间存在显著统计学差异。当功率为1 W∙cm−2时,最高可以达到56℃,较初始温度升高了26.3℃,说明其具有优异的体外光热升温性能。
注:*:各组间相比,P < 0.05;**:两组间相比,P < 0.01;***:与其余三组相比,P < 0.001。
Figure 3. (a) Heating effect of H2O and Ti3C2@Au suspension (0.05 mg∙mL−1) irradiated by NIR (808 nm, 0.75 W∙cm−2) for 10 min. (b) Heating effect of Ti3C2@Au suspension (0.1 mg∙mL−1) irradiated by NIR (808 nm) with different powers (0.25, 0.5, 0.75, 1 W∙cm−2) for 5 min
图3. (a) H2O和Ti3C2@Au悬液(0.05 mg∙mL−1)用808 nm、0.75 W∙cm−2的激光照射10 min的升温效应。(b) Ti3C2@Au悬液(0.1 mg∙mL−1)经808 nm、不同功率(0.25、0.5、0.75、1 W∙cm−2)的NIR照射5 min的升温效应
注:(1) 对照组;(2) NIR组;(3) DOX组;(4) DOX@Ti3C2@Au组;(5) DOX@Ti3C2@Au + NIR组。ns:无统计学差异;*:与对照组相比,P < 0.05;**:与对照组相比,P < 0.01;***:与对照组相比,P < 0.001。
Figure 4. (a) The cell survival rate after coincubation with different concentrations Ti3C2@Au suspensions (0, 150, 300, 450, 600 ppm) for 24 h. (b) The cell survival rate of each group
图4. (a) 4T1细胞与不同浓度Ti3C2@Au-PEG悬液(0、150、300、450、600 ppm)共孵育24 h后的细胞存活率。(b) 各处理组的细胞存活率
3.3. 细胞实验
考虑到纳米复合载体在生物医学领域的实际应用,其细胞毒性成为一个关键性问题。CCK-8试验显示(图4(a)),即使Ti3C2@Au-PEG纳米复合载体的浓度达到600 ppm时,细胞仍保持较高的存活率(平均值为96.1%),且在各浓度下,其细胞存活率与对照组相比,无统计学差异(P > 0.05),这表明Ti3C2@Au-PEG纳米复合载体无明显细胞毒性,这为进一步体内研究和将来的临床应用转化提供了可能性。此外,按表1所示分组给予4T1细胞相应处理后,进行CCK-8试验,结果如图4(b)所示,各组细胞存活率与对照组相比,均存在统计学差异,这说明各疗法均可取得一定疗效,但DOX@Ti3C2@Au + NIR组治疗效果最明显,其细胞存活率仅为17.8%,且与对照组之间存在显著统计学差异(P < 0.001),这说明PTT联合化疗的综合抗乳腺癌效果最佳,有望取代单一疗法成为更好的治疗策略。此外,光热效应不仅本身可以通过高热导致肿瘤细胞死亡,而且可能有效增加细胞通透性,从而加强细胞对药物和载体的摄取,进一步导致肿瘤细胞死亡。
4. 结论
综上所述,本研究成功制备了基于Au NPs修饰MXene的纳米复合递药体系DOX@Ti3C2@Au-PEG,Ti3C2@Au-PEG纳米载体具有良好的光热升温性能,表现出极低的细胞毒性,巨大的表面有利于药物负载,可以用作稳定的肿瘤协同治疗的递药载体。该纳米复合递药体系,在细胞实验中初步展现出良好的PTT协同化疗的综合抗乳腺癌效果,说明联合疗法优于各单一疗法,这表明MXene在纳米递药生物医学领域具有广阔的应用前景,值得进行下一步探索。
基金项目
山东省自然科学基金资助项目(ZR2017MH042)。
致谢
刘爱萍负责设计实验、进行实验、数据整理分析和文章撰写,刘耿君和李雅欣参与部分细胞实验,王海燕负责课题总体构思和修改文章。
NOTES
*通讯作者,Email: why_phd@163.com。