1. 引言
“桂柚1号”是2010年通过广西农作物品种审定委员会审定的一个沙田柚自花结果变异优良品种。其自花授粉坐果率高达1.71%~9.7%,完全不需异花授粉即可获得高产;果实风味甜脆化渣,采收时可溶性固形物含量高达10.8%~19.0%,总糖量8.06%~14.95%,柠檬酸0.23%~0.46%,维生素C 63.09~140.70 mg/100 ml;每果种子数91.3~155.7粒。为提高“桂柚1号”的产品附加值,本文对种子的主要活性成分及潜在药理作用开展了相关分析研究工作。据文献报道,柚子果实(包括外表皮、内表皮、内果皮、果肉、种子)中的主要化学组分包括醇类、酯类、烯烃类、有机酸类、酮类等,其中,种子中含量最高的是亚油酸在内的油脂脂肪酸类物质 [1]。柚子的全果综合利用研究对于推动产业发展十分有益,但是目前的研究主要局限于柚皮提取物的研究,种子的研究还较少 [2]。除脂肪酸类物质外,柚子种子中还包括了如新橙皮苷、柚皮苷和柠檬苦素等在内的多种糖类和糖苷类物质(图1),这些物质往往具有较高的药理活性,比如抗肿瘤、抗焦虑、抗疟疾、增强抗氧化性、防止动脉粥样硬化、降血脂等作用。另一方面,已上市的作为治疗糖尿病新型药物钠–葡萄糖协同转运蛋白-2 (SGLT-2)抑制剂达格列净(图1) [3],就是属于糖苷类物质,它与新橙皮苷、柚皮苷、柠檬苦素等具有一定的结构类似性。因此,对柚子种子中的糖苷类成分进行提取、分离、鉴定和抗糖尿病活性研究具有理论基础和重要的应用前景。
糖尿病是当前威胁人类健康的最重要的慢性非传染性疾病之一,目前针对糖尿病已开发出了多个不同类型的抗糖尿病药物。其中,钠–葡萄糖协同转运蛋白2 (SGLT-2)的抑制剂通过抑制葡萄糖在肾小管中的重吸收过程而达到降低血糖的作用,同时还可以降低血浆胰岛素的分泌,增加血浆胰高血糖素水平,使肝脏内源性葡萄糖生成增加,降低低血糖发生的风险 [4]。已上市的SGLT-2抑制剂类抗糖尿病药物的结构基本都属于糖苷,包括卡格列净(通用名:Canagliflozin;商品名:Invokana)、达格列净(通用名:Dapagliflozin;商品名:Forxiga)、伊格列净脯氨酸(通用名:Ipragliflozin L-Proline;商品名:Suglat)、艾格列净(通用名:Empagliflozin;商品名:Jardiance)等,此外尚有约10个药物处于临床研究阶段。
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Figure 1. Chemical structure of main active ingredient from seeds of “Guiyou No.1” and the positive drug dagligin
图1. “桂柚1号”种子中主要活性成分及阳性药物达格列净的化学结构
在此基础上,作者进行了“桂柚1号”种子中柠檬苦素及其类似物和类黄酮化合物的提取分离与结构鉴定工作,并选取SGLT-2为主要分子评价模型,开展了“桂柚1号”种子有效活性成分对糖尿病的药效与药理作用的研究,以期开发“桂柚1号”的医疗保健作用,为“桂柚1号”的综合利用提供科技支撑。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
实验取材在广西柑橘生物学重点实验室完成,“桂柚1号”果实成熟后取种子,用无菌水洗净表面果肉于通风处沥干,干燥后保存于−20℃冰箱。
实验分析在中山大学完成,分析所用柠檬苦素、橙皮苷、柚皮苷等标准品均购自Sigma公司。
2.2. “桂柚1号”种子主要活性成分的提取与结构鉴定
取一定量“桂柚1号”种子烘干,用粉碎机打成粉末状。称取500 g种子粉末于锥形瓶中,用2 L石油醚在实验室温度下(27℃)脱脂48 h。脱脂后的液体在室温下经减压抽滤得到滤渣。过滤后在65℃下经旋转蒸发滤液回收石油醚,得到209.1 g柚子油。
1) 柠檬苦素及其类似物的提取:向滤渣中加入2 L丙酮,在27℃条件下萃取166 h。50℃下旋蒸回收丙酮,得到浆状母液。母液分两次提纯。向母液中加50 mL石油醚再脱脂48 h,室温减压抽滤后得到黄色固体即为柠檬苦素及其类似物诺米林。随后,通过柱层析分离法进一步提纯目标产物,得到接近白色的固体。经结构鉴定为柠檬苦素,质量为38 mg。提取得到的纯品化合物经高效液相色谱(HPLC)及核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定结构。
2) 类黄酮化合物的提取:向滤渣中加入2L 90%乙醇,在20℃条件下提取115 min。78℃下经旋转蒸发回收乙醇,得到浆状母液。向母液中加50 mL石油醚再脱脂48 h,室温减压抽滤后得到32 g黄色固体(类黄酮化合物)。通过柱层析分离法,进一步分离目标产物,分别得到两个主要产物,经HPLC及1H-NMR鉴定分别为柚皮苷和新橙皮苷,质量分别为65 mg和12 mg。
2.3. “桂柚1号”种子主要成分对SGLT-2活性的抑制作用检测
1) 细胞培养:培养稳定表达SGLT-2的Flp-in CHO细胞株,培养基组成为F12培养基 + 500 μg/ml潮霉素 + 10%胎牛血清。待细胞长到80%满时,用PBS清洗细胞三次,之后加入5 ml胰酶-EDTA溶液进行消化,调整细胞密度为3 × 105个/ml,按100 μL/孔的量接种至96孔细胞培养板中培养待用。
2) 待检测活性成分配制:待检测活性成分用100% DMSO溶解至贮存浓度20 mmol/L;起始浓度设为2 μmol/L,以4倍等比稀释的方法依次在96孔板内稀释10个浓度梯度,制成100×的待检测活性成分板。在一块新的96孔板上加入45 μL孔的KRH-Na+缓冲液(120 mM NaCl,4.7 mM KCl,1.2 mM MgCl2,2.2 mM CaCl2,10 mM HEPES;pH = 7.4)和5 μL/孔的100×的待检测活性成分,制成10×的待检测活性成分板备用。
3) 放射性酶联免疫法检测SGLT-2活性:以150 μL/孔的KRH-NMG缓冲液(120 mM NMG,4.7 mM KCl,1.2 mM MgCl2,2.2 mM CaCl2,10 mM HEPES;pH = 7.4)洗涤步骤(1)中接板的细胞一次。弃去缓冲液,加入45 μL/孔的含有2.5 μCi/ml的14C-AMG溶液,立即加入5 μL/孔的10×待检测活性成分,振荡混合后于37 ℃培养1 h。在每个孔中加入150 μL/孔的清洗缓冲液(120 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0.5 mM phlorizin; pH = 7.4)清洗三次,吸干孔内液体。加入20 μL/孔的100 mM NaOH,振荡5分钟。加入80 μL/孔的闪烁液Microsint 40到所有孔中,振荡5分钟,在MicroBeta Trilux(PerkinElmer)仪器上测定放射活性;用GraphPad软件计算各待检测活性成分对SGLT-2活性的半数抑制浓度IC50。
2.4. “桂柚1号”种子主要活性成分的初步药效作用研究
1) 小鼠葡萄糖耐受实验:选取18~22 g检疫合格的雄性昆明小鼠,禁食不禁水24 h,将实验动物随机分为以下组别:空白组,模型空白组,阳性药物10 mg/kg组,阳性药物50 mg/kg组,阳性药物250 mg/kg组,新橙皮苷10 mg/kg组,新橙皮苷50 mg/kg组,新橙皮苷 250 mg/kg组,柚苷10 mg/kg组,柚苷50 mg/kg组,柚苷250 mg/kg组。每组4只小鼠。
将每只小鼠称重记录后按如下给药方案进行给药:空白组先以200 μL/20 g的剂量给予生理盐水然后给予5‰ CMC-Na溶液(100 μL/20 g);模型组先以2 g/kg的剂量给予葡萄糖溶液后立即给予5‰ CMC-Na溶液(100 μL/20 g);阳性药物组和待测药物各浓度组均先给予2 g/kg的葡萄糖溶液后立即给予一定浓度的药物溶液。其中,阳性药物为Dapagliflozin (达格列净)。所有受试药物均以5‰ CMC-Na溶液溶解至待测终浓度。
给药后,用罗氏罗康全卓越金锐型血糖仪,于0、0.5、1、1.5和2 h行尾静脉采血进行血糖水平监测。不同药物随时间变化的血糖水平作折线图进行分析。
2) 糖尿病小鼠降血糖效果检测:采用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型,经灌胃连续给药3周后测定小鼠空腹血糖值,比较不同药物降血糖效果。选取18~20 g正常昆明雄性小鼠46只,禁食不禁水16 h,按200 mg/kg的剂量腹腔注射四氧嘧啶0.9% NaCl溶液,72 h后测空腹血糖,选取血糖值大于11.00 mmol/L的小鼠为造模成功小鼠(共40只)。
按完全随机试验设计法分为模型对照组、阳性对照组、新橙皮苷组和柚苷组,每组10只。除模型对照组外,给药组每日分别给予2 mg/kg的达格列净、新橙皮苷或柚皮苷,模型对照组每天等体积的0.9% NaCl溶液灌胃,连续3周,末次给药后禁食12 h,剪尾采血,用血糖仪测空腹血糖,观察其对血糖的影响。
3. 结果与分析
3.1. “桂柚1号”种子主要活性成分的提取、分离及结构鉴定
据文献报道,柚核中的主要成分包括柠檬苦素及其类似物、类黄酮化合物(如柚皮苷等)、油脂脂肪酸类、蛋白质及其他矿物元素等。其中,油脂脂肪酸类物质较多,但主要具有药理活性的成分集中在柠檬苦素及其类似物和类黄酮化合物。因此,本文以柠檬苦素和类黄酮化合物为主要目标,开展了活性成分的提取、分离及结构鉴定工作。500 g柚子核粉得到丙酮萃取黄色固体(柠檬苦素和诺米林) 2.1 g,获得率为0.42%。HPLC法检测结果显示黄色固体中柠檬苦素占30%~40%。通过柱层析分离法,进一步提纯目标产物,得到接近白色的固体。1H-NMR图谱分析结果表明化合物结构为柠檬苦素,质量为38 mg。该化合物的HPLC和1H-NMR图谱见图2。
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Figure 2. HPLC chromatogram and 1H-NMR spectrum of limonin
图2. 柠檬苦素的HPLC图谱(上图)及1H-NMR图谱(下图)
3.2. “桂柚1号”种子类黄酮化合物的提取、分离及结构鉴定
500 g柚子核粉得到乙醇萃取黄色固体32 g,获得率为6.4%。通过柱层析分离法,进一步分离目标产物,分别得到两个主要产物,经结构鉴定分别为柚皮苷和新橙皮苷,质量分别为65 mg和12 mg。柚皮苷和新橙皮苷的HPLC和1H-NMR图谱见图3和图4。
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Figure 3. HPLC chromatogram and 1H-NMR spectrum of naringin
图3. 柚皮苷的HPLC图谱(上图)及1H-NMR图谱(下图)
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Figure 4. HPLC chromatogram and 1H-NMR spectrum of neohesperidin
图4. 新橙皮苷的HPLC图谱(上图)及1H-NMR图谱(下图)
3.3. “桂柚1号”种子主要成分对SGLT-2活性的作用影响评价
为初步研究以上提取得到的主要成分的抗糖尿病作用,首先以SGLT-2为目标,采用放射性酶联免疫法对醇浸提物、丙酮浸提物和提取得到的柠檬苦素、柚皮苷、新橙皮苷抑制SGLT-2的活性进行了检测。由图5可知,阳性药物达格列净可显著抑制SGLT-2的活性,其半数抑制浓度(IC50)为0.5 nmol/L,与文献报道基本一致,说明试验设计可靠。醇浸提物具有一定的抑制活性,其IC50为51 ng/μL,而丙酮浸提物则无明显抑制活性,说明活性成分主要存在于醇浸提物中。进一步对醇浸提物中分离纯化得到的产物柚皮苷、新橙皮苷和柠檬苦素进行检测,发现三者对SGLT-2均有一定的抑制活性,抑制能力新橙皮苷 > 柚皮苷 > 柠檬苦素。以上结果表明,“桂柚1号”种子中提取分离得到的新橙皮苷和柚皮苷等成分具有一定的抑制SGLT-2活性的作用。
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Figure 5. Inhibitory effects of tested compounds on SGLT-2 activity
图5. 受试化合物对SGLT-2活性的抑制作用及拟合得到的IC50值
3.4. “桂柚1号”种子主要活性成分的药理作用初步评价
接下来,我们选用对SGLT-2有较明显抑制作用的新橙皮苷和柚皮苷为对象进一步开展了在动物水平上的抗糖尿病作用研究。首先进行的是药物对正常小鼠糖耐量的影响。由图6可知,模型组在餐后0.5 h血糖水平明显增高,直至餐后2 h才明显下降至餐前水平,即糖耐量降低,说明造模成功。阳性药物达格列净可以显著降低小鼠餐后血糖,使小鼠糖耐量增加,说明试验方案可靠。由图7可知,受试药物新橙皮苷和柚皮苷均表现出不同程度的降低小鼠餐后血糖、增加小鼠糖耐量的作用,且这一作用具有浓度依赖性。对比新橙皮苷和柚皮苷的作用,发现新橙皮苷的降血糖作用略强于柚皮苷。
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Figure 6. Changes in blood glucose levels in mice treated with positive control dapagliflozin
图6. 阳性药物达格列净给药后小鼠血糖水平变化
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Figure 7. Changes in blood glucose levels in mice treated with neohesperidin and naringoside
图7. 新橙皮苷和柚皮苷给药后小鼠血糖水平变化
进一步采用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型,经灌胃连续给药3周后测定小鼠空腹血糖值,比较不同药物在糖尿病模型小鼠上的降血糖效果。由表1可见,阳性对照组、新橙皮苷组、柚皮苷组给药后血糖值与给药前比较有明显差异(P < 0.01)。三个给药组均表现出了降低糖尿病模型小鼠血糖的作用,其中,阳性对照组降糖率最高,为55.07%,新橙皮苷和柚皮苷的降糖作用弱于阳性对照药物达格列净,但也显示出了一定的降糖作用,降糖率分别为31.29%和26.32%。
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Table 1. Effect of neohesperidin and naringin on blood glucose in diabetic mice
表1. 新橙皮苷和柚皮苷对糖尿病小鼠血糖的影响
注:降糖率 = (给药前 − 给药后)/给药前;给药前后比较**P < 0.01。
4. 讨论
沙田柚是我国传统优良柚类品种,作为广西特产,其果大质优耐贮藏,素有“天然罐头”的美称,深受消费者的青睐 [5]。在广西,沙田柚主要分布在容县、阳朔、平乐、恭城、贺州、苍梧、融水、宜州、临桂等县市,已成为广大果农致富的支柱产业之一 [6] [7]。但沙田柚自交不亲和,单性结实能力弱,自花结果率极低,人工自花授粉坐果率只有1.55%~1.99% (以授粉花数量为基数),在自然自花授粉情况下,坐果率仅0%~0.47%,可以说基本上不结果 [8] [9] [10],必须用酸柚等品种的花粉进行人工异花授粉才能正常结果,但人工异花授粉在人工工资日益增长的情况下成本劣势影响已愈来愈大。
自交亲和结果新品种“桂柚1号”的选育对沙田柚产业的升级换代具有十分重要的现实意义。“桂柚1号”是沙田柚的优良变异品种,自然自花结果率1.71%~9.7%,丰产稳产性好,品质优良。其种子数较多,每果种子数可达91.3~155.7粒,因此开展种子活性成分研究对“桂柚1号”综合利用具有重要意义。
作为柑橘属植物最重要的栽种种类之一,柚子果实中所含有的生物活性物质与柑橘果实有较大的相似性,除富含糖类、蛋白质、脂肪、维生素等多种营养物质外,还含有包括类黄酮、类胡萝卜素、类柠檬苦素、香精油、膳食纤维和香豆素类等多种生物活性物质 [11]。其中,在柚子果皮和果实中含有大量的类黄酮化合物,这些结构已被报道具有广泛的抗氧化、抗炎、预防动脉粥样硬化、抗癌和抗菌等活性作用,是重要的生物活性物质。
对柚子的活性成分研究多集中于对其果实和果皮的研究,对种子的活性成分则较少见于报道。这主要是因为种子中含有大量的油脂和淀粉,对提取和分离造成了较大的困难。为此,本文以石油醚脱脂为主要工艺,首先建立了从柚子种子中提取分离主要活性成分的方法,经石油醚脱脂后的脂肪油部分和滤渣部分可分别进行回收利用,有效的获得了种子中的活性成分。分离得到的油脂脂肪酸类物质较多,但主要具有药理活性的成分集中在柠檬苦素及其类似物和类黄酮化合物。
柠檬苦素类似物是三萜类的植物次生代谢产物,至今已从柑桔属植物中分离和鉴定的36种柠檬苦素类化合物约及17种柠檬苦素类似物配糖体,常见的有柠檬苦素、诺米林、脱乙酰诺米林、黄柏酮、米林酸等,它们都是具有呋喃环的三萜类化合物。作为其代表具有强烈苦味的为柠檬苦素和诺米林。柠檬苦素的分子式C26H30O8,别名黄柏内酯、吴茱萸内酯,主要存在于芸香科柑橘属植物果实,如枳实(脐橙、柑桔、香橙)柚等中。以果核中含量较高,果皮中含量较少。柠檬苦素类似物具有抗癌、抗氧化、抑菌、抗炎镇痛、除虫杀虫、抑制HIV病毒复制、降低胆固醇等多种生物活性。但对于该类结构的抗糖尿病活性很少有报道。本文对从“桂柚1号”种子中提取得到的柠檬苦素的抗糖尿病活性进行了分子水平的研究,发现其具有一定的抑制SGLT-2的活性,即有可能在体内抑制葡萄糖的重吸收。
另一方面,如前所述,柑橘属中类黄酮含量丰富,易于分离,具有显著的药理学作用,主要分布在成熟果实的果皮、果肉和种子中。一般来说,柑橘属中类黄酮主要以糖苷和糖苷配基的形式存在,其中柚皮苷和橙皮苷是以糖苷配基形式存在的两种重要的黄烷酮。本文报道了从“桂柚1号”种子中分离得到的含量最高的两个类黄酮化合物——柚皮苷和新橙皮苷的抗糖尿病活性。这两个化合物不仅在分子水平,同时也在动物水平体现出了较好的抗糖尿病活性,具有进一步开发研究的价值。
总的来说,“桂柚1号”种子主要活性成分是柠檬苦素、柚皮苷和新橙皮苷等,而这些成分具有抗肿瘤、抗焦虑、抗疟疾、增强抗氧化性、防止动脉粥样硬化、降血脂等作用,特别是本文发现了这几个主要活性成分在抗糖尿病中的潜在应用价值,表明了“桂柚1号”种子活性成分开发利用前景广阔。这一结果为开发和推广“桂柚1号”新品种提供了重要的科学支撑。
资助项目
广西创新驱动发展专项(桂科AA17204097-2);广西科技计划项目(桂科AB16380145);广西柑橘创新团队栽培岗位(nycytxgxcxtd-05-02);广西柑橘生物学重点实验室课题(SYS2015X003)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。