改性竹炭对正己烷生物降解过程的强化机理

Mechanism of Biodegradation of N-Hexane by Bamboo Charcoal

摘要: 正己烷作为重要的工业原料被广泛应用，但其会对人体健康和大气环境造成严重危害。微生物技术凭借反应条件温和、环境友好、运行费用低和操作简单等优点越来越受到关注，但正己烷的超强疏水性导致了生物法难以高效去除正己烷。本文研究了一种双金属改性竹炭(Fe-Pd/BC)，并将其应用于正己烷的生物降解。实验结果表明，在Fe-Pd/BC投加浓度为0.05 g∙L⁻¹、NH₄⁺浓度3 g∙L⁻¹、pH 7.7、温度35℃条件下，300 mg∙L⁻¹的正己烷去除率在35 h可达94.63%。此外，在Fe-Pd/BC存在的情况下，与对照组相比，细胞疏水性从22.61%提高至45.78%，胞外蛋白质含量从38.14 μg∙mL⁻¹提高至46.27 μg∙mL⁻¹，细胞表面zeta电位从−14.7 mV降低至−18.4 mV。进一步的实验表明，Fe-Pd/BC可以通过参与细菌生长、提高zeta电位绝对值、暴露大量蛋白质疏水基团、增加CSH来提高正己烷的生物降解效率。本研究的结论证实通过添加Fe-Pd/BC来提高微生物降解效果是一种很有前景的正己烷废气治理技术。

Abstract: N-hexane is widely used as an important industrial raw material, but it will cause serious harm to human health and atmospheric environment. Microbial technology has attracted more and more attention because of its mild reaction conditions, friendly environment, low operation cost and simple operation. However, the super hydrophobicity of n-hexane makes it difficult for biological method to remove n-hexane efficiently. A bimetallic modified bamboo charcoal (Fe-Pd/BC) was studied and applied to the biodegradation of n-hexane. The experimental results show that under the conditions of Fe-Pd/BC concentration of 0.05 g∙L⁻¹, NH₄⁺ concentration of 3 g∙L⁻¹, pH 7.7 and temperature of 35˚C, the removal rate of n-hexane of 300 mg∙L⁻¹ could reach 94.63% in 35 h. In addition, in the presence of Fe-Pd/BC, compared with the control group, the cell hydrophobicity increased from 22.61% to 45.78%, and the content of extracellular protein increased from 38.14 μg∙L⁻¹ increased to 46.27 μg∙L⁻¹. The cell surface potential decreased from −14.7 mV to −18.4 mV. Further experiments show that Fe-Pd/BC could improve the biodegradation efficiency of n-hexane by participating in bacterial growth, increasing the absolute value of zeta potential, exposing a large number of protein hydrophobic groups and increasing CSH. The conclusion of this study confirmed that adding Fe-Pd/BC to improve the microbial degradation effect is a promising n-hexane waste gas treatment technology.

1. 引言

挥发性有机化合物(Volatile organic compounds, VOCs)的产生和排放对生态环境和人类健康具有广泛的不良影响。正己烷是VOCs的一种，作为重要的工业原料被广泛应用，其水溶性较低，比甲苯、苯等难溶性挥发有机物更难溶于水 [1]。处理正己烷废气常用的方法有燃烧法、溶液吸附法、膜分离法、生物法等 [2]。

与一般的物理、化学技术相比，微生物技术凭借反应条件温和、环境友好、运行费用低和操作简单等优点脱颖而出，受到国内外学者的广泛关注 [3]。然而，正己烷疏水性的特点对传统的生物法具有极大的限制，也是导致生物可降解性较差的主要原因。增加微生物对疏水性正己烷的捕获能力是解决生物可生化性较差的关键 [4]。

细胞表面疏水性(Cell surface hydrophobicity, CSH)是微生物的一个重要的特性，不但决定了细菌黏附到非生物表面和界面的情况，而且也显著影响了微生物对疏水性化合物的降解效率 [5]。尽管正己烷在水中的溶解度很低，但细菌可利用CSH与正己烷通过疏水–疏水相互作用进行粘附 [6]。疏水–疏水相互作用被认为是非极性基团自发聚集的趋势，以使其与水分子的接触最小化，这些相互作用是加快细胞与VOCs进行物质传递的主要原因 [7]。因此，CSH可促进细胞与VOCs的相互作用，并进一步充当细胞在亲水性液相中进行物质交换的触发力。

有学者观察到，在微生物降解正己烷的过程中通过添加竹炭(Bamboo charcoal, BC)可以增强正己烷的代谢能力，而Pd-Fe负载后的BC可将细菌外膜关键蛋白酶置于疏水环境中，促进了微生物对正己烷的亲和力 [8]。Pseudomonas mendocina NX-1是在之前的研究中从废水污泥中分离出来的，它可以利用正己烷作为细菌生长和代谢的唯一碳源。本文拟研究Fe-Pd/BC对菌株NX-1降解正己烷性能的影响，主要研究以下内容：1) Fe-Pd/BC对菌株NX-1降解正己烷性能的影响；2) Fe-Pd/BC对菌株NX-1表面疏水性的影响；3) 以表面疏水性为重点，Fe-Pd/BC对微生物降解正己烷影响的机理。

2. 材料与方法

2.1. 试剂

Luria-Bertani液体培养基主要成分：酵母提取物5 g∙L⁻¹；氯化钠10 g∙L⁻¹；蛋白胨10 g∙L⁻¹ (pH 7.0)。最小培养基(MM)溶液如下：Na₂HPO₄∙12H₂O 4.5 g∙L⁻¹；KH₂PO₄ 1.0 g∙L⁻¹；(NH₄)₂SO₄ 2.5 g∙L⁻¹；MgSO₄∙7H₂O 0.20 g∙L⁻¹；CaCl₂ 0.023 g∙L⁻¹；微量元素1 mL。微量元素主要成分：FeSO₄∙7H₂O 1.0 g∙L⁻¹；CuSO₄∙5H₂O 0.05 g∙L⁻¹；H₃BO₃ 0.014 g∙L⁻¹；MnSO₄∙4H₂O 0.10 g∙L⁻¹；Na₂MoO₄∙2H₂O 0.02 g∙L⁻¹；CoCl₂∙6H₂O 0.02 g∙L⁻¹。R₂A琼脂培养基主要成分：酵母提取物0.50 g∙L⁻¹；蛋白胨0.5 g∙L⁻¹；丙酮酸钠0.5 g∙L⁻¹；葡萄糖0.5 g∙L⁻¹；可溶性淀粉0.5 g∙L⁻¹；KH₂PO₄ 0.30 g∙L⁻¹；MgSO₄∙7H₂O 0.05 g∙L⁻¹。所有试剂均购自阿拉丁，纯度为分析纯。

2.2. BC与菌株来源

本实验中使用的BC粉购自浙江江山绿意竹炭有限公司。通过共沉淀法将Fe-Pd负载于BC表面以完成对BC的改性：2 g竹炭加入硫酸亚铁盐溶液(7.5 g FeSO₄∙7H₂O，200 mL去离子除氧水)中置于磁力搅拌器上，超声处理20 min，少量多次加入2.5 g NaBH₄和0.15 g K₂PdCl₆。烘箱干燥处理24 h后，去离子水洗涤3次后再次烘干得到Fe-Pd/BC样品。

所选微生物从浙江省某制药厂废水处理池的活性污泥中筛选分离出来，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，中国；CCTCC编号M2015114)中。Pseudomonas mendocina NX-1用R₂A培养基活化后接种于MM培养基(30℃，160 r∙min⁻¹)，光密度(OD₆₀₀)为0.6。将5 mL细胞悬浮液和5 mg BC-Fe/Pd在100 mL MM中与正己烷混合后转移至150 mL锥形瓶中。

2.3. 表征与分析方法

通过扫描电子显微镜(SEM, Hitachi, S-570)对Fe-Pd/BC和菌株NX-1进行了表征。

通过气相色谱仪GC (Agilent 6890, USA)分析正己烷的浓度。HP-INNOWAX毛细管柱(长30 m，内径0.32 mm，膜厚0.5 μm)用于分离。载气(氦气)流速为2.1 mL∙min⁻¹。操作条件如下：火焰离子化检测器(FID)；温度：300℃；分流比：3:1；烘箱温度：80℃；入口温度：300℃；进样量：1 mL。

胞外聚合物(Extracellular polymeric substance, EPS)的测量：将样品在4℃，6000 rpm条件下离心5分钟。倒出上清液，之后用PBS (pH 7)洗涤3次，在12,000 rpm下离心10 min。然后将样品均质化以分离EPS和细菌。用50 mL PBS重悬离心后的样品，60℃下孵育3 h。最后将混合物的上清液离心来测定EPS的浓度。

菌株NX-1的CSH通过对碳氢化合物的粘附性(MATH)来测定 [9]。

Zeta电位采用Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90, UK)测定 [10]。

3. 结果与讨论

3.1. Fe-Pd/BC和NX-1的形貌表征

图1(a)显示了Fe-Pd/BC表面的微观结构，其表面复杂粗糙，这种现象的出现猜测是由Fe-Pd纳米颗粒(50~100 nm)在BC表面的不均匀分散负载引起的。搅拌不足和其他因素会导致Pd-Fe在BC表面聚集，形成链状或块状的颗粒形态 [11]。图1(b)显示菌株NX-1被Fe-Pd/BC所包围，表明Fe-Pd/BC成功负载与菌株NX-1表面，未显示出明显的生物毒性。

Figure 1. SEM of Fe-Pd/BC (a) and Fe-Pd/BC with strain NX-1 (b)

图1. Fe-Pd/BC (a)和Fe-Pd/BC与菌株NX-1 (b)的电镜图

3.2. Fe/Pd-BC对NX-1降解正己烷的影响

3.2.1. Fe/Pd-BC浓度对NX-1降解正己烷效率的影响

Figure 2. Effect of Fe/Pd-BC dosage on the degradation efficiency of n-hexane

图2. Fe/Pd-BC投加量对正己烷降解效率的影响

控制正己烷浓度为300 mg/L，以5%的接种量将生长对数期的菌液接种至新鲜MM中，在30℃、160 rpm/min条件下培养35 h，考察Fe/Pd-BC投加量对菌株NX-1正己烷降解效率的影响。如图2所示，在MM中分别加入0.02、0.05、0.07、0.10、0.12 g的Fe/Pd-BC，NX-1对正己烷的降解率分别为85.25%、94.63%、92.78%、87.14%、82.33%。添加0.02 g的Fe/Pd-BC的降解体系在10 h处率先达到最大降解率，但随着反应的进行，添加0.05 g的Fe/Pd-BC降解体系最终呈现最大降解率，说明适当浓度的Fe/Pd-BC能加速菌株NX-1对正己烷的降解效率，如果Fe/Pd-BC浓度过低，难以对菌株NX-1的生化性能起到显著的促进作用，但如果Fe/Pd-BC含量过高，则会抑制菌株NX-1对正己烷的降解，推断其原因是因为BC表面负载的Fe/Pd金属离子浓度过高会进入细胞，影响细胞酶活性，导致降解率下降。

3.2.2. 正己烷初始浓度对NX-1降解正己烷的影响

Figure 3. Effect of initial n-hexane concentration on degradation efficiency

图3. 底物初始浓度对正己烷降解效率的影响

控制Fe/Pd-BC投加量0.05 g、接种量5%、pH = 8.0，然后分别在反应体系中加入100、200、300、350、400、500 mg/L正己烷，在30℃、160 rpm/min条件下培养35 h，正己烷降解效率分别为96%、95.5%、96.6%、92%、88%和80%。通过如图3可知，在不同初始底物浓度条件下，菌株NX-1表现出不同的生物降解率，底物浓度太低或太高均不利于细菌的生长和相关酶的活性提高。同时可以发现菌株NX-1具有较强的正己烷耐受性，当正己烷浓度达到400 mg/L时，仍然能保持较高的降解率，但是当正己烷浓度达到500 mg/L时会对菌株NX-1产生抑制作用。

3.3. Fe/Pd-BC增强正己烷生物降解的机理

3.3.1. Fe/Pd-BC对菌株NX-1的CSH的影响

Table 1. Effects of Fe-Pd/BC on CSH of strain NX-1

表1. Fe-Pd/BC对菌株NX-1 CSH的影响

生物法难以降解正己烷的主要原因是正己烷具有极高的疏水性。有研究表明，疏水性VOCs的降解会受到CSH的影响，VOCs的降解率与CSH呈正相关关系，细胞表面疏水性越高细菌的VOCs降解能力越强，主要是因为疏水性VOCs更容易被高疏水性的细菌捕捉和吸附进而促进细菌降解。通过表1可知，经过18 h的培养后，添加Fe/Pd-BC的菌株NX-1，其CSH提高了23.17%。有学者发现高CSH的细菌更容易附着在疏水性底物表面和疏水性底物形成的液滴表面，从而促进疏水性VOCs的降解 [12]。因此本文推测Fe/Pd-BC通过提高细胞表面CSH强化细菌对正己烷的捕捉能力，进而提高降解效率。

3.3.2. CSH对菌株NX-1分泌EPS的影响

EPS的主要有机成分是蛋白质(PN)、多糖(PS)和腐殖质类物质，纯培养中细胞的EPS主要是PN和PS。通过表2可知，具有较大CSH的菌株NX-1，其表面分泌的PN呈现增加趋势，而PS呈现减少的现象。大量报道证明PN对CSH起主要作用，乙酰化的PS也可形成疏水基团，从而影响EPS的疏水性。有学者研究表明CSH的高低主要取决于PN含量，PN含量较高的细菌会具有较大的CSH，进而促进细菌对碳氢化合物的吸收和降解，因此CSH的增加可以归因于PN含量的增加 [13] [14]。

正己烷的去除性能可能取决于多种因素，EPS可以通过调节表面电荷或疏水性来改变细菌的表面性质，这对正己烷的降解至关重要 [15]。细菌在Fe/Pd-BC表面的积累促进了EPS的形成。表2显示，在Fe/Pd-BC存在下，PS的浓度从39.16 μg∙mL⁻¹降低到32.44 μg∙mL⁻¹，而PN从38.14 μg∙mL⁻¹增加到46.27 μg∙mL⁻¹。结果表明，Fe/Pd-BC与菌株的接触可能会改变细菌外膜的生长和代谢。

Table 2. EPS of strain NX-1 under different culture conditions

表2. 不同培养条件的NX-1的胞外聚合物

3.3.3. CSH对NX-1的Zeta电位的影响

Figure 4. Effect of Fe/Pd-BC on Zeta potential of strain NX-1

图4. Fe/Pd-BC对菌株NX-1 Zeta电位的影响

如图4所示，在整个pH范围内，所有的Zeta电位都是负值，这两条电位曲线随着pH的升高呈现相同的下降趋势，低CSH具有相对较低的Zeta电位。Zeta电位的变化反映了细胞疏水性与表面电荷之间的负相关关系，细胞表面性质的变化利于细菌适应有毒碳氢化合物存在的环境 [16]。

先前的研究表明，CSH与Zeta电位的绝对值正相关 [17]。因此，添加Fe/Pd可以促进BC表面上的NX-1生长并改善NX-1的CSH。有学者发现正己烷的去除与细胞的疏水性呈正相关，这可能表明本研究中正己烷去除效率的提高与Fe/Pd对CSH的增加有关 [18]。生物膜会根据不同条件下的环境压力交换亲水或疏水表型。Fe/Pd-BC通过动态调节细胞EPS的组成来增加PN含量和Zeta电位，从而在其表面产生额外的等电电荷。相同电荷的相互排斥使体系稳定，PN分子的聚集和Zeta电位的绝对值降低。这种现象会使疏水基团的暴露，从而导致NX-1的表面疏水性增加 [19]。

3.3.4. CSH对菌体接触角的影响

通过图5可知，菌株NX-1的接触角为27.4˚ (三次取平均)，添加Fe/Pd-BC后菌株NX-1的接触角增加到40.1˚ (三次取平均)，虽然细菌仍为亲水性，但相对来说，疏水性有所增加，说明Fe/Pd-BC可以增加细胞表面疏水性。有研究发现，恶臭假单胞菌DOT-T1E会通过改变细胞表面电荷和疏水性来适应有毒的正构烷醇，细胞暴露于正构烷醇后，细胞表面疏水性会急剧增加，接触角立刻从30˚增加到85˚，证明细胞表面疏水与接触角的增加有关 [17]。

Figure 5. Effect of Fe/Pd-BC on the contact angle of strain NX-1

图5. Fe/Pd-BC对菌株NX-1接触角的影响

4. 结论

本文研究结果证实了Fe/Pd-BC对Pseudomonas mendocina NX-1降解正己烷的影响。结果表明，菌株NX-1在Fe/Pd-BC浓度为0.05 g∙L⁻¹、 ${\text{NH}}_4^{+}$ 浓度为3 g∙L⁻¹、pH = 7.7，温度为35℃的条件下对300 mg∙L⁻¹的正己烷有94.63%的降解能力。此外，在Fe-Pd/BC存在的情况下，与对照组相比，细胞疏水性从22.61%提高至45.78%，胞外蛋白质含量从38.14 μg∙mL⁻¹提高至46.27 μg∙mL⁻¹，细胞表面zeta电位从−14.7 mV降低至−18.4 mV。进一步的实验表明，Fe-Pd/BC可以通过参与细菌生长、提高zeta电位绝对值、暴露大量蛋白质疏水基团、增加CSH来提高正己烷的生物降解效率。本研究的结论证实通过添加Fe-Pd/BC来提高微生物降解效果是一种很有前景的正己烷废气治理技术。

基金项目

本项目为浙江树人学院大学生科技创新活动资助项目。

NOTES

^*通讯作者。