紫苏醛在烟曲霉菌性角膜炎中的保护作用

Protective Effect of Perillaldehyde on Aspergillus fumigatus Keratitis

摘要: 目的：探讨紫苏醛(PAE)对小鼠烟曲霉菌感染性角膜炎的保护作用及机制。方法：我们使用烟曲霉菌感染的C57BL/6小鼠用于体内实验，通过眼前节照相以及炎症评分来评估紫苏醛对于感染小鼠角膜的保护作用。苏木精–伊红(HE)染色用来观察紫苏醛对感染角膜中炎症细胞浸润的影响，过碘酸希夫(PAS)染色观察紫苏醛对感染角膜组织中真菌负荷的影响。采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测烟曲霉菌感染小鼠角膜及RAW264.7细胞中炎症因子IL-6、MIP-2、CXCL-1及模式识别受体TLR4 mRNA的表达。RT-PCR检测脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞中IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA 表达水平。结果：烟曲霉菌感染的小鼠角膜经过紫苏醛处理后，溃疡面积减小，混浊程度减轻，临床炎症评分下降。紫苏醛处理可抑制角膜中炎症细胞的浸润，减轻真菌负荷。RT-PCR结果显示，紫苏醛处理可及减少烟曲霉菌感染小鼠角膜和RAW264.7细胞中TLR4、IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA表达水平。我们使用LPS特异性激动TLR4，结果显示，紫苏醛可以抑制由TLR4介导的下游炎症因子IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA水平的升高。结论：紫苏醛改善小鼠烟曲霉菌性角膜炎的预后，减少炎症细胞的募集及真菌负荷。紫苏醛通过抑制TLR4介导的信号通路，抑制下游炎症因子的释放。

Abstract: Objective: To explore the protective effect of perillaldehyde (PAE) on Aspergillus fumigates (A. fumigatus) keratitis in mice and the following mechanism. Methods: We used A. fumigatus infected C57BL/6 mice for the experiments in vivo. The protective effect of PAE on infected corneas was evaluated by anterior segment photography and clinical score. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the effect of PAE on the infiltration of inflammatory cells in infected corneas, and the fungal load in mice corneas was observed by Periodic Acid Schiff (PAS) staining. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of inflammatory cytokines IL-6, MIP-2, CXCL-1 and pattern recognition receptor TLR4 in infected mice corneas and RAW264.7 cells. We also used RT-PCR to measure the mRNA expression of IL-6, MIP-2 and CXCL-1 in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Results: PAE treatment remarkably decreased the area of ulcer, the degree of turbidity, and the clinical score of the mice corneas infected with A. fumigatus. PAE treatment could inhibit the infiltration of inflammatory cells and reduce the fungal load of the infected corneas. RT-PCR results showed that PAE could reduce the mRNA expression of TLR4, IL-6, MIP-2 and CXCL-1 in A. fumigatus infected corneas and RAW264.7 cells. We used LPS to specifically activate TLR4. The results showed that PAE pre-treatment could inhibit the mRNA levels of the downstream inflammatory factors IL-6, MIP-2 and CXCL-1 mediated by TLR4. Conclusion: PAE could improve the prognosis of A. fumigatus keratitis, reduce the infiltration of inflammatory cells and fungal load, and inhibit the release of inflammatory factors mediated by TLR4.

1. 引言

真菌性角膜炎是由曲霉菌和镰刀菌等真菌病原体引起的感染性眼病，可造成严重的视力损害 [1]。植物相关外伤、角膜接触镜的过度使用、不规范使用广谱抗生素和激素都可能导致发病率增加 [2]。中国是农业大国，植物性外伤更容易为真菌性角膜炎的发生和发展提供机会 [3]。目前临床使用的抗真菌药物存在角膜局部渗透性差、眼部刺激性强、毒性较大等缺点 [4]，导致真菌性角膜炎的治疗十分棘手。因此，寻找新的有效的抗真菌药物是临床亟待解决的问题。

真菌性角膜炎的发生和发展不仅包括真菌的直接损伤，而且与真菌入侵引起过度的炎症反应加重局部组织破坏密切相关 [5]。固有免疫是机体抵抗真菌感染的第一道防线。当角膜被感染时，固有免疫被激活，真菌细胞壁中的病原体相关分子模式(PAMPs)会被模式识别受体(PRRs)识别，促进炎症细胞向病变部位浸润，介导下游的免疫炎症反应，产生炎症细胞因子，以抵抗病原体的侵袭 [4] [6]。过度炎症反应诱导大量免疫细胞、炎症因子和细胞毒性物质在感染部位积累，可能加重角膜损伤并延迟愈合伤口，严重者造成角膜穿孔 [7] [8]。因此，控制过度的炎症反应也是真菌性角膜炎的重要的治疗手段。

紫苏醛是紫苏中提取的主要成分，因其显著的抗真菌、抗炎、抗氧化等作用受到关注 [9] [10]。研究表明，紫苏醛间接干扰麦角甾醇的生物合成，导致真菌细胞膜的破坏，进而对黑曲霉菌起到杀菌作用 [11]；紫苏醛还可以通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖性线粒体途径诱导黄曲霉凋亡 [10]。同时，也有研究证明紫苏醛可以通过下调炎性小体的表达进而抑制IL-1β和IL-18的分泌，减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤的炎症反应 [12]；通过减少中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞数量，对阴道念珠菌病具有治疗作用 [13]。这些研究为紫苏醛在真菌性角膜炎中的应用提供了基础。我们前期研究发现紫苏醛对烟曲霉性角膜炎有一定的治疗作用 [14]。但是，其具体的机制还需要进一步探索。

本文探讨了紫苏醛在烟曲霉菌感染的角膜炎中的抗真菌、抗炎作用及其可能的机制。我们的研究表明，紫苏醛可以减轻真菌负荷，并且通过抑制TLR4介导的信号通路，来抑制炎症细胞因子的分泌。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

紫苏醛(CAS-No.18031-40-8)购自TCI株式会社(日本东京)。二甲基亚砜(DMSO)购自北京Solarbio公司。脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich (美国)。雌性C57BL/6小鼠(8周龄)购自济南朋悦公司，经检验检疫均合格，全身情况良好。裂隙灯下观察小鼠，排除眼部疾患。实验动物使用符合美国眼科和视觉研究协会(ARVO)关于动物使用的标准。RAW264.7细胞系从中国科学院(上海)获得。

2.2. 烟曲霉菌培养与菌丝的制备

将烟曲霉菌3.0772菌株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)，接种于Sabouroud琼脂固体培养基(Solarbio)，置于恒温箱内孵育，待其生长良好时，于无菌超净操作台中用PBS (含0.1% Tween 20)冲洗培养基，收集孢子。洗涤、离心(4℃、12,000 g、5分钟)、弃上清、重悬，4℃保存。将标准烟曲霉菌菌株接种于经过高压消毒后的含300 ml Sabouroud液体培养基的无菌烧瓶内，纱布严密包扎瓶口。置于37℃的120 rpm摇床培养箱中培养。当生长至团块状菌丝形态时，收集菌丝并研磨，PBS洗涤、离心(4℃、4500 rpm、10分钟)、弃上清。菌丝中加入75%的酒精吹打混匀后置于4℃冰箱过夜灭活菌丝。次日离心后弃上层酒精，PBS洗涤3次。最后离心弃PBS上清，加入DMEM细胞培养液混匀，制成灭活菌丝悬液，调整菌丝最终使用浓度为1 × 10⁸ CFU/ml。

2.3. 真菌性角膜炎小鼠模型的建立

使用8%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉小鼠。在眼科手术显微镜下，使用30 G一次性注射器针头在小鼠右眼角膜做隧道，达角膜基质层，使用10 μL Hamilton微量注射器将2.5 μL孢子悬液(1 × 10⁷ CFU/mL)注射至小鼠右眼角膜基质层，左眼作为空白对照组。将小鼠随机分为紫苏醛治疗组和DMSO治疗组，感染后第一天根据分组结膜下注射紫苏醛(6 mM)或者DMSO (1%) 5 uL，自感染后第二天，给予小鼠紫苏醛(6 mM)或者DMSO (1%)每日3次点眼治疗。在建模后的第1、3、5天，裂隙灯下观察小鼠角膜病情变化并评估临床评分。评估标准与之前实验相同 [15]。

2.4. HE染色

将感染后3天小鼠眼球置于OCT包埋剂中，液氮速冻后制作冷冻切片，厚度为10 μm，37℃下烤片2小时。PBS浸洗3遍，苏木精染色8分钟，自来水浸洗3遍，1%盐酸酒精分化20秒，自来水浸洗3遍，氨水中和1分钟，自来水浸洗3遍，伊红染色30秒，自来水水浸洗3遍，入85%、90%、95%、无水乙醇梯度脱水，二甲苯中透明5分钟，中性树胶封片。使用光学显微镜观察并拍照(400×)。

2.5. 过碘酸希夫(PAS)染色

将感染后3天小鼠眼球置于OCT包埋剂中，液氮速冻后制作冷冻切片，厚度为10 μm，37℃下烤片2小时。PBS浸洗3遍，过碘酸溶液室温氧化10分钟，蒸馏水浸洗，Schiff Reagent浸染15分钟，亚硫酸钠溶液滴洗2次，流水冲洗，苏木素染色2分钟，流水冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯中透明5分钟，封片。使用光学显微镜观察并拍照(400倍)。

2.6. RAW细胞处理

将接种于12孔板中的RAW264.7细胞于温箱培养至接近80%融合，加入紫苏醛(600 μM)或DMSO (0.1%)预处理2小时，给予灭活烟曲霉菌菌丝或者LPS (100 ng/mL)刺激，感染8小时后收集细胞用于RT-PCR实验，检测TLR4、IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA表达水平。

2.7. RT-PCR

2.7.1. Total RNA的提取

将含有研磨后角膜组织或者RAW264.7细胞的RNA裂解液的EP管置于冰盒上裂解30分钟。4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液入另一新的EP管中，加入与RNA裂解液1/5体积量相等的氯仿，混匀后，4℃、12,000 rpm离心15分钟，取上清液入另一新的EP管中；向装有上清液的EP管中加入异丙醇，混匀后，4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃上清，加入500 Ml 75%乙醇，混匀后，4℃、12,000 rpm离心10分钟，弃上清，待乙醇挥发。向EP管中加入DEPC水溶解RNA沉淀，充分离心–振荡–离心后立刻测定RNA的含量及纯度。

2.7.2. Total RNA含量及浓度测定

调整核酸浓度分析设备的OD值归0，分别测样本在260 nm、280 nm处的OD值以及OD260/OD280比值，测量三次取平均值。根据RNA浓度计算上样量。

2.7.3. 逆转录

按照Prime Script RTreagent Kit With gDNA Eraser (大连宝生物工程有限公司)试剂逆转录步骤，配置相应混合待测液，置PCR仪上进行基因扩增反应。条件为：95℃预变性30 s→95℃变性5 s、60℃ 30 s (40个循环)→95℃退火、延伸15 s→60℃ 30 s→95℃溶解15 s。根据样本的内参及目的基因循环数，计算相对表达量。引物序列见表1。

Table 1. Primer sequence of target gene

表1. 目的基因引物序列

2.8. 统计学方法

实验数据以平均值 ± SEM的形式表示，并通过GraphPad 8.0软件进行分析。通过 Mann-Whitney U检验确定不同组的临床评分。用未配对双尾t检验对RT-PCR结果进行分析，^*P < 0.05，^**P <0.01，^***P < 0.001，被视为有统计学意义，ns被视为无统计学意义。重复所有实验至少3次以确保准确性。

3. 结果

3.1. 紫苏醛减轻小鼠烟曲霉菌性角膜炎临床评分

小鼠角膜感染烟曲霉菌后第1、3和5天在裂隙灯下进行眼前节照相。与DMSO组相比，紫苏醛处理显著减小溃疡面积和混浊程度(图1(A))。临床评分显示，感染后第3天和第5天，紫苏醛治疗组评分明显低于DMSO对照组临床评分(图1(B))，差异有统计学意义。

注：(A) 烟曲霉菌感染小鼠角膜1、3、5天后DMSO处理组与紫苏醛处理组眼前节照相；(B) 烟曲霉菌感染小鼠角膜1、3、5天后DMSO处理组与紫苏醛处理组临床评分比较(n = 6 组) (^*P < 0.05，^***P < 0.001，ns被视为无统计学意义)。

Figure 1. PAE treatment alleviated the severity of A. fumigatus (AF) keratitis in mice cornea

图1. 紫苏醛处理减轻小鼠烟曲霉菌性角膜炎的严重程度

3.2. 紫苏醛抑制小鼠感染角膜组织中的炎症细胞浸润及真菌负荷

角膜组织切片HE染色显示，感染后第3天，DMSO组可见基质层中有大量炎性细胞浸润，而紫苏醛治疗减少了炎性细胞的数量(图2(A)、图2(B))。通过PAS染色法可以检测感染角膜中的真菌负荷，角膜组织切片的PAS染色显示，在感染后第3天，紫苏醛处理组角膜中菌丝含量明显低于DMSO对照组，且角膜水肿程度减轻(图2(C)、图2(D))。

注：烟曲霉菌感染小鼠角膜3天后DMSO处理组(A)与紫苏醛处理组(B) HE染色照片；烟曲霉菌感染小鼠角膜3天后DMSO处理组(C)与紫苏醛处理组(D) PAS染色照片(n = 3, 400×)。

Figure 2. PAE treatment reduced inflammatory cells infiltration and fungal load of A. fumigatus (AF) keratitis in mice cornea

图2. 紫苏醛处理减少小鼠烟曲霉菌角膜炎的炎性细胞浸润及真菌负荷

3.3. 紫苏醛降低小鼠烟曲霉菌角膜炎中促炎因子的表达

我们进一步检测了感染小鼠角膜中促炎细胞因子的表达。RT-PCR结果显示，与对照组相比，紫苏醛在感染3天小鼠角膜中显着降低了炎症因子IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA水平(图3(A)~(C))，差别具有统计学意义。

注：烟曲霉菌感染小鼠角膜3天后，与DMSO处理组相比，紫苏醛处理组IL-6、MIP-2、CXCL-1mRNA水平降低(n = 6/组) (A~C)。烟曲霉菌感染RAW264.7细胞8小时后，与DMSO组相比，紫苏醛预处理组IL-6、MIP-2、CXCL-1mRNA 水平降低(D~F) (^*P < 0.05，^***P < 0.001，ns被视为无统计学意义)。

Figure 3. PAE inhibited the mRNA levels of pro-inflammatory factors in the mice cornea and RAW264.7 cells infected with A. fumigatus

图3. 紫苏醛处理抑制了烟曲霉菌感染小鼠角膜和RAW264.7细胞中促炎因子mRNA的表达

3.4. 紫苏醛降低RAW264.7细胞中促炎因子的表达

紫苏醛预处理RAW264.7细胞2小时后，加入灭活烟曲霉菌刺激。RT-PCR结果显示，单纯烟曲霉菌处理组IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA表达水平升高，而紫苏醛预处理则显著降低了IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA表达(图3(D)~(F))，差别具有统计学意义。

3.5. 紫苏醛抑制小鼠烟曲霉菌性角膜炎中TLR4的表达

为了探索紫苏醛抗炎的机制，我们检测了烟曲霉菌感染小鼠角膜和RAW264.7中模式识别受体TLR4的表达，RT-PCR结果提示，相对于DMSO处理组，紫苏醛处理组TLR4的mRNA表达量明显降低，差别具有统计学意义(图4)。

注：烟曲霉菌感染小鼠角膜3天后，与DMSO处理相比，紫苏醛处理组TLR4 mRNA水平降低(n = 6/组) (A)。烟曲霉菌感染RAW264.7细胞8小时后，与DMSO组相比，紫苏醛预处理组TLR4 mRNA水平降低(B) (^***P < 0.001，ns被视为无统计学意义)。

Figure 4. PAE inhibited the mRNA levels of TLR4 in the mice cornea and RAW264.7 cells infected with A. fumigatus

图4. 紫苏醛处理抑制了烟曲霉菌感染小鼠角膜和RAW264.7细胞中TLR4的表达mRNA表达

3.6. 紫苏醛抑制LPS刺激的RAW264.7中促炎因子mRNA的产生

我们使用TLR4特异性激动剂LPS刺激RAW264.7细胞，来检测下游因子的变化。RT-PCR结果显示，单独使用LPS处理组的细胞中IL-6、MIP-2、CXCL-1的mRNA水平升高，而紫苏醛预处理显着降低了LPS刺激后升高的炎症因子水平，差别具有统计学意义(图5)。

4. 讨论

真菌性角膜炎是由一种由致病真菌引起的严重的致盲性疾病 [16]。我国是农业大国，真菌性角膜炎的发病率也居高不下 [17]。目前，临床应用的抗真菌药物特异性差，缺乏抗炎作用 [18]，极大地限制了它们的应用，迫切需要找到高效、低毒的新型抗真菌药物。

紫苏醛是从紫苏中提取的天然单萜物质，因其具有较强的抗真菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性，应用广泛 [10] [19] [20]。本研究中，我们验证了紫苏醛对于烟曲霉菌感染小鼠角膜的治疗作用。眼前节照相提示紫苏醛处理组的感染小鼠角膜与DMSO组相比，水肿程度减轻、溃疡面积减小、虹膜纹理更加清晰，对应的炎症评分也下降显著，两组相比，差距有统计学意义。HE染色显示感染后第3天，感染组角膜水肿加重，伴有大量炎症细胞浸润，基质层纤维结构紊乱，经紫苏醛处理后的角膜中炎症细胞明显减少，组织结构较完整。已有研究证实紫苏醛可以减少感染白色念珠菌小鼠的阴道组织中中性粒细胞、巨噬细胞和CD4 T细胞数量，这与我们的研究一致 [13]。我们前期对于紫苏醛的抗真菌作用研究发现，它可以抑制烟曲霉菌菌丝的数量并能影响其形态 [14]。本实验中，我们通过PAS染色观察小鼠角膜切片，结果发现紫苏醛可以减少感染角膜中菌丝数量并且阻止菌丝向深层浸润，进一步证实了紫苏醛的抑真菌作用。为了验证紫苏醛的抗炎作用，我们在烟曲霉菌感染小鼠角膜中对炎症因子进行了检测，RT-PCR结果显示，感染后的小鼠角膜中IL-6、MIP-2、CXCL-1表达增高，而紫苏醛处理会抑制它们的表达。MIP-2、CXCL-1都属于CXC趋化因子家族，表现出强大的中性粒细胞、单核/巨噬细胞的趋化活性，协助多形核中性粒细胞(PMNs)招募到损伤或感染部位，从而调节免疫和炎症反应 [21] [22]。紫苏醛对趋化因子的抑制，进一步验证了我们前期实验中紫苏醛可以减少烟曲霉菌感染角膜中的中性粒细胞的募集 [14]。同样，在烟曲霉菌刺激的巨噬细胞中也检测到上述促炎因子的表达增加，而在紫苏醛处理后表达下调。这与最近的研究中紫苏醛能够通过抑制炎症因子IL-6、TNFα的产生来减缓DSS诱导的结肠炎的结果相一致 [23]。

注：LPS刺激RAW264.7细胞8小时后，与单纯LPS处理组相比，紫苏醛预处理组IL-6、MIP-2、CXCL-1mRNA 水平降低(A~C) (^**P < 0.01，^***P < 0.001，ns被视为无统计学意义)。

Figure 5. PAE inhibited the mRNA levels of pro-inflammatory factors in the RAW264.7 cells stimulated by LPS

图5. 紫苏醛处理抑制了LPS刺激的RAW264.7细胞中促炎因子mRNA的表达

在真菌性角膜炎固有免疫中，上皮细胞通过细胞表面的模式识别受体，如Toll样受体(TLRs)、C型凝集素受体(CLRs)、核苷酸结合寡聚化域样受体(NLRs)等，识别真菌细胞壁表面的病原菌相关分子模式，进而介导级联炎症反应 [24]。我们已有研究发现模式识别受体TLR4在烟曲霉菌感染后表达上升 [25]，提示在真菌性角膜炎过程中紫苏醛可能通过抑制TLR4的表达来抑制过度炎症。为此，我们使用特异性激动剂LPS来刺激RAW264.7细胞，结果显示紫苏醛处理显著降低了由LPS激动的TLR4介导的下游炎症介质的增加，提示紫苏醛可能通过抑制真菌诱导的TLR4信号通路来抑制促炎因子的表达。

综上所述，本实验进一步证实了紫苏醛在真菌性角膜炎中的抗真菌和抗炎作用，这可能与其抑制TLR4及其介导的下游的炎症级联反应有关，提示紫苏醛可能成为治疗真菌性角膜炎行之有效的药物。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]