摘要: 目的：探讨吉贝咳喘胶囊止咳、平喘、祛痰潜在活性成分和可能的作用机制。方法：通过TCMSP、Swiss Target Prediction、Uniprot等数据库并结合文献挖掘吉贝咳喘胶囊的活性成分和作用靶点，通过OMIM、Genecards生物数据库筛选出咳嗽、痰、哮喘的相关靶点，取两者交集，将交集靶点导入STRING数据库的PPI网络，筛选核心靶点，将其导入David数据库进行基因本体(GO)功能、京都基因和基因百科全书(KEGG)通路富集分析。结果：筛选出吉贝咳喘胶囊168个活性成分和797个潜在靶点，9894个疾病相关靶点，药物与疾病共有629个交集靶点。吉贝咳喘胶囊可能通过调节HIF1A、IL-6、MMP9、AKT1、MAPK3等靶点，干预PI3K-Akt通路、MAPK通路、TNF通路、HIF-1通路、癌症通路等相关信号通路，从而达到止咳、平喘、祛痰的作用。结论：该研究通过网络药理学方式预测了吉贝咳喘胶囊止咳、平喘、祛痰的主要活性成分、靶点和相关通路，可为进一步研究提供参考。
Abstract:
Objective: To study the potential active ingredients of Jibei Kechuan Capsule for antitussive, antiasthmatic and expectorant and its possible mechanism of action. Methods: Combining literature with TCMSP, Swiss Target Prediction, Uniprot and other databases obtained the active ingredients and targets of Jibei Kechuan Capsules. The OMIM and Genecards biological databases screened out targets related to cough, asthma, and sputum, and the intersection of the two was selected. Then importing the intersection targets into the STRING database obtained PPI network. Screening the core targets and putting them into the David database conducted enrichment analysis. Results: 168 active ingredients and 797 potential targets of the preparation were screened out, 9894 targets related to cough, asthma, and sputum. There are a total of 629 intersection targets between the two. Jibei Kechuan Capsules may interfere with PI3K-Akt pathway, MAPK pathway, TNF pathway, HIF-1 pathway, cancer pathway and other related signal pathways by regulating HIF1A, IL-6, MMP9, AKT1, MAPK3 and other targets, so as to achieve suppression. It had the effect of relieving cough, relieving, asthma, and expectorating. Conclusion: This study predicts the main active ingredients, targets and related pathways of Jibei Kechuan Capsule for antitussive, antiasthmatic and expectorant through network pharmacology, which can provide reference for further research.
1. 引言
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见、可以预防和治疗的慢性呼吸系统疾病，以持续性的气流受限为主要特征，与吸入烟草烟雾等有害气体和肺泡异常相关 [1]。最常见的症状包括呼吸困难、咳嗽和(或)咳痰，由于COPD发病率高、病程迁延、病情反复、治疗费用高昂，严重影响患者生活质量，增加社会和家庭负担 [2]，如今已成为广泛关注的疾病。目前临床主要采用支气管扩张剂(LABA)、皮质类固醇(ICS)、长效胆碱能抗剂(LAMA)等药物的联合治疗，由于价格昂贵、难以有效缓解病情、容易复发，且存在多种不良反应。而中医药在治疗COPD时具有症状缓解能力强、复发率低、不良反应少等优势。
中医学认为，COPD属于“咳嗽”“喘证”“肺胀”范畴，其病位在肺，病机为痰热阻肺，故应以清热化痰、止咳平喘为治则 [3]。中医药治疗COPD主要是化痰止咳平喘药、清热药等，如玉屏风散、健脾化痰汤等经典复方制剂 [4] [5]，中药多成分多靶点的作用方式和其毒性低灵活性高的用药方式在治疗COPD上表现出良好前景。吉贝咳喘胶囊由麻黄、黄芩、毛大丁草、浙贝母等11味药材组成，具有清热宣肺、化痰散结、平喘止咳之功效。研究表明，临床应用于COPD痰热郁肺证，复发率低，不良反应少，能有效控制COPD患者的症状和体征，提高临床疗效 [6]。治疗呼吸系统慢性病多为外邪引发宿痰，本制剂以外邪引发宿痰化热为病证基础，以清热化痰、止咳平喘祛邪来治疗，既重视病证根本病因宿痰，又重视急性发作的诱发因素。现代研究表明吉贝咳喘胶囊具有止咳、平喘、祛痰等作用 [7]。然而，吉贝咳喘胶囊止咳、平喘、祛痰的作用机制尚不清楚。鉴于此，本研究基于网络药理学探讨吉贝咳喘胶囊止咳、平喘、祛痰的作用机制，以期为进一步研究提供参考。
2. 方法
2.1. 吉贝咳喘胶囊活性成分及靶点的获取
通过中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)结合NCBI数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)、CNKI数据库(https://www.cnki.net/)等数据库，检索并筛选11味中药活性成分及靶点信息，将筛选出吉贝咳喘胶囊活性成分对应的靶点，通过Uniprot (http://beta.uniprot.org/)数据库，设定物种为“Homo sapiens”对靶点进行标准化处理，将其转换成与之相对应的基因名称，并使用Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库对靶点信息进行补充，删减重复后并归一整合，最终获得吉贝咳喘胶囊的活性成分及其靶点数据集。
2.2. 疾病的靶点获取
利用Genecards数据库(http://www.genecards.org/)和OMIM数据库(https://omim.org/)以“cough”、“phlegm”、“asthma”为关键词检索疾病相关靶点，删除重复靶点并归一整合获得咳嗽、痰和哮喘疾病靶点集。
2.3. “中药–成分–靶点”网络构建
将筛选后活性成分的作用靶点与咳嗽、痰和哮喘相关疾病靶点进行映射，筛选出共同靶点，并绘制韦恩图。将中药活性成分与其靶点数据集导入cytoscape 3.8.2软件，利用cytoscape 3.8.2软件构建“中药–成分–靶点”网络。
2.4. 构建蛋白相互作用(PPI)网络
将“2.3”项下筛选出的药物与疾病的交集靶点导入STRING数据库(https://www.string-db.org/)，限定物种“Homo sapiens”并以置信度 ≥ 0.7，得到蛋白–蛋白相互作用(PPI)网络。将STRING数据库中的.tsv文件导入cytoscape 3.8.2进行拓扑分析，分析网络连接度(degree)，degree值越高，表明该节点在网络中越重要，选择degree大于其中位数值(median) 2倍以上的节点作为关键候选靶点。提取候选节点网络关系，分析网络节点的3个拓扑特征值“度中心性(degree centrality, DC)”、“介度中心性(betweenness centrality, BC)”和“接近中心性(closeness centrality, CC)”其中拓扑结构特征值越大，网络节点越重要，选择3个特征值均大于其相应中位数的节点作为关键靶点。
2.5. GO富集分析和KEGG信号通路分析
将“2.4”项下筛选出的关键靶点，导入DAVID数据库(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)对其进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，以P < 0.05进行筛选，基于此得到吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰和哮喘的生物学过程和关键信号通路。
3. 结果
3.1. 吉贝咳喘胶囊潜在活性成分及靶点
通过TCMSP数据库限定(OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18)再结合文献检索筛选出麻黄、黄芩、浙贝母、炙僵蚕、炙桑白皮、炙葶苈子、吉祥草、毛大丁草、地龙、天竺黄、蛤壳的活性成分总共168个，其中麻黄21个、黄芩31个、浙贝母5个、炙僵蚕22个、炙桑白皮23个、炙葶苈子9个、吉祥草12个、毛大丁草22个、地龙11个、天竺黄8个、蛤壳4个，将活性成分对应的靶点输入Uniprot数据库，并使用Swiss Target Prediction数据库对靶点信息进行补充，删除去重，共筛选出797个药物靶点。药物活性成分及靶点情况如表1，复方中活性成分根据OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18值，11味中药活性成分交集的基本信息见表2。
Table 1. Basic information of “active ingredient-target” of Jibei Kechuan Capsules
表1. 吉贝咳喘胶囊“活性成分–靶点”基本信息
Table 2. Intersection compound information table of Jibei Kechuan Capsules
表2. 吉贝咳喘胶囊交集化合物信息表
注：a.毛大丁草；b.黄芩；c.麻黄；d.炙桑白皮；e.炙葶苈子；f.地龙；g.天竺黄；h.浙贝母；i.炙僵蚕；j.吉祥草；k.蛤壳。
3.2. 疾病靶点
通过Genecards数据库和OMIM数据库相并集得到咳嗽、痰、哮喘疾病靶点共9894个，与吉贝咳喘胶囊相交集靶点为629个(图1)。
Figure 1. Venn diagram of the targets of Jibei Kechuan capsules in the treatment of cough, phlegm, and asthma
图1. 吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰、哮喘的靶点韦恩图
3.3. “中药–成分–靶点”网络的构建
将吉贝咳喘胶囊各味中药、活性成分、靶点导入cytoscape 3.8.2软件构建“中药–成分–靶点”网络(图2)，结果显示：该网络共有1068个节点、5163条边，表示活性成分和潜在靶点之间的作用关系。网络中同一活性成分可作用于不同靶点，而不同活性成分也可共同作用于同一靶点，体现了吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、哮喘、痰具有多成分多靶点的协同作用特点。
Figure 2. Network of “Traditional Chinese Medicine-Ingredients-Target”
图2. 中药–成分–靶点网络图
3.4. 构建PPI网络
将上述吉贝咳喘胶囊与咳嗽、痰、哮喘的交集靶点分别利用STRING数据库进行分析，得到蛋白互作网络(图3)，分析得出节数点分别为627、边数分别为5365、平均节点度值分别为17.1。将其结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行拓扑分析，并选取degree > 2倍中位数的候选关键靶点202个，最后采用3个拓扑特征值筛选得到41个关键靶点(图4)。
Figure 3. The key target PPI network of Jibei Kechuan Capsule in the treatment of cough, sputum and asthma
图3. 吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰、哮喘的关键靶点PPI网络
Figure 4. Target screening flowchart of key nodes of Jibei Kechuan Capsules
图4. 吉贝咳喘胶囊关键节点的目标筛选流程图
3.5. GO富集分析和KEGG信号通路分析
为了更全面且深入研究吉贝咳喘胶囊止咳、平喘、祛痰的作用机制，吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰、哮喘的靶点导入DAVID数据库进行GO生物过程分析和KEGG通路富集分析。结果显示，吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰、哮喘的关键靶点涉及共318条GO生物过程(P < 0.05)，包括生物学过程(BP) 250条，分子功能(MF) 42条，细胞组成(CC) 26条，绘制各类别前10的条目(见图5)，主要集中在细胞胞外间隙、胞浆和线粒体外膜中，并涉及了药物反应、酶结合、蛋白质结合、细胞因子活性、蛋白激酶活性等。KEGG信号通路富集分析得到89条可能与吉贝咳喘胶囊治疗咳嗽、痰、哮喘的作用机制有关的信号通路(前20条通路气泡图见图6) (P < 0.01)，主要包括癌症通路、乙型肝炎通路、TNF通路、PI3K-Akt通路、MAPK通路等。
Figure 5. GO biological function enrichment analysis
图5. GO生物功能富集分析
Figure 6. Enrichment analysis of KEGG signaling pathway
图6. KEGG信号通路富集分析
4. 讨论
吉贝咳喘胶囊由麻黄、毛大丁草、黄芩、浙贝母、地龙、炙桑白皮、炙葶苈子、炙僵蚕、吉祥草、蛤壳、天竺黄等11味药材组成，上述之药皆能入肺经治肺病。麻黄，辛、微苦，取宣肺平喘之义；毛大丁草，入肺经以清热解毒、止咳化痰；黄芩，味苦性寒入肺经具有清热燥湿，泻火解毒；浙贝母苦，寒，入肺心经以清热化痰止咳，解毒散结消痈；蛤壳之苦、咸，寒以清肺化痰兼以散结；吉祥草，能润肺止咳；桑白皮甘、寒归肺经，泻肺平喘；葶苈子，归肺经，泻肺平喘；天竺黄，味甘，性寒能入心经以清热豁痰、清心定惊；僵蚕咸、辛，平以化痰散结；地龙咸，寒入肺经以通络、平喘。诸药合理配伍，具有清热宣肺，化痰散结，平喘止咳之功效 [8]。
通过对吉贝咳喘胶囊中的有效成分进行分析，部分化合物已经证实具有治疗咳嗽、痰、哮喘的作用，尤其是一些与基因关联较多的活性成分木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、槲皮素、豆甾醇等，木犀草素能够有效地减轻哮喘幼鼠的氧化应激反应 [9]。β-谷甾醇可通过抑制铜绿假单胞菌依赖的蛋白激酶C的α亚型表达，从而改善患者肺部炎症 [10]，柚皮素具有止咳化痰平喘的作用 [11]。槲皮素对气道炎症有抑制作用，对哮喘反应具有缓解作用 [12]。豆甾醇可调节哮喘豚鼠的气道炎症 [13]。
通过对吉贝咳喘胶囊PPI网络和富集分析，核心靶点为HIF1A、IL-6、MMP9、JUN、TP53、AKT1、MAPK3等，主要通过干预PI3K-Akt通路、MAPK通路、TNF通路、HIF-1通路、癌症通路等相关信号通路达到治疗COPD过程中咳嗽、痰、哮喘相关症状的作用。查阅文献可知，体外研究发现高迁移率族蛋白B1(HMGB1)可调节PI3K/Akt通路，诱导人气道平滑肌细胞(HASMC)的增殖和迁移参与哮喘气道重塑防治 [14]；β-谷甾醇干预颗粒细胞后P-AKT和P-PI3KCA表达上调，β-谷甾醇组促进颗粒细胞增殖 [15]；咳嗽变异性哮喘患儿外周血miR-146a表达上调，可能通过下调Th1/Th2比例，促进IL-6、TNF-α分泌，参与咳嗽变异性哮喘的发生 [16]；麻杏石甘汤可能通过降低MMP-9和TIMP-1的表达改善哮喘模型小鼠气道重塑状态 [17]；MAPK在人体细胞内存在多条通路，并且广泛参与哮喘的发生与发展，p38MAPK通路可促进炎症反应，调控Th1/Th2细胞因子的比例，诱导细胞间黏附分子表达 [18]。研究表明HIF-1α在治疗COPD中密切相关 [19]；真核起始因子6 (eIF6)可以激活多个AKT相关的癌症信号通路以调节结直肠癌(CRC)中的细胞增殖、侵袭、细胞周期和凋亡 [20]。
5. 结论
综上所述，吉贝咳喘胶囊镇咳、平喘、祛痰主要通过PI3K-Akt通路、乙型肝炎通路、MAPK通路、TNF通路、HIF-1通路、癌症通路等通路途径，以达到控制咳嗽、痰、哮喘的发生发展，但本研究只是在分子机制上进行探讨预测，具体药物作用机制仍需进一步实验进行验证。
基金项目
贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(项目合同编号：黔科合中专[2004]44号)；贵阳市科技局中药现代化专项(项目合同编号：[2007]筑科农合同字第3-1号)。
NOTES
*通讯作者。