摘要: 目的：基于网络药理学方法分析麻黄定喘汤治疗哮喘的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取麻黄定喘汤中各药的主要化学成分与其靶点，依据ADME对活性组分进行筛选；通过Genecards，OMIM，DRUGBANK数据库获取哮喘主要靶点，两者取交集后通过String平台对交集靶点进行蛋白质相互作用分析，构建PPI网络并采用Cytoscape3.7.2软件对PPI网络中蛋白质功能模块进行挖掘。通过Metascape平台对交集靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果：从麻黄定喘汤中共得到化学成分188个，共涉及靶点247个，与哮喘相关的基因1051个，二者取交集后获得120个麻黄定喘汤治疗哮喘的靶标，包括信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 (CHRM3)，α2A肾上腺素能受体(ADRA2A)，μ阿片受体(OPRM1)，趋化因子10 (CXCL10)，趋化因子8 (CXCL8)，分裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)，肿瘤坏死因子(TNF)等核心靶点，GO富集分析与KEGG通路富集分析显示麻黄定喘汤可以影响细胞对毒性物质的反应，调控MAPK级联反应，调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，TNF信号通路，NF-κB信号通路等通路。结论：该研究预测了麻黄定喘汤治疗哮喘的潜在作用机制，初步揭示了麻黄定喘汤多成分、多靶点、多通路的作用特点。
Abstract:
Objective: To explore the mechanisms of Mahuang Dingchuan Decoction in the treatment of asthma based on network pharmacology. Methods: Active ingredients and targets of Mahuang Dingchuan Decoction were collected from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), screening of active ingredients based on ADME; tar-gets of asthma were retrieved from Genecards, OMIM, DRUGBANK database, after the intersec-tion of the two, the protein interaction analysis was performed on the intersection through String datebase, a protein interaction network was constructed and Cytoscape3.7.2 wad used to mine protein functional modules in the network. Gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were per-formed on the Metascape platform. Result: A total of 188 chemical components were obtained from Mahuang Dingchuan Decoction, involving 247 targets, and 1051 targets related to asthma, after the intersection,120 targets of Mahuang Dingchuan Decoction were determined to treat asthma, including Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), Muscarinic ace-tylcholine receptor M3 (CHRM3), Alpha-2A adrenergic receptor (ADRA2A), Mu-type opioid re-ceptor (OPRM1), C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10), Interleukin-8 (CXCL8), Mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), Tumor necrosis factor (TNF) and other core targets. GO analysis and KEGG analysis prove that Mahuang Dingchuan Decoction can affect cellular response to toxic substance, regulation of MAPK cascade and regulate AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, TNF signaling pathway, NF-kappa B signaling pathway and other pathway. Con-clusion: The study predicted the potential mechanisms of Mahuang Dingchuan Decoction in the treatment of asthma, and initially revealed the multi-component, multi-target, multi-pathway characteristics of Mahuang Dingchuan Decoction.
1. 引言
哮喘是临床上常见的呼吸系统疾病，是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病 [1]。哮喘发病机制复杂，涉及炎症反应，免疫反应与变态反应机制等，其临床表现主要为发作性咳嗽、胸闷、呼气性呼吸困难等。中国大陆成人哮喘患病率达1.81%，并且其患病率有逐年增加的趋势，哮喘已是严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病 [2]。
中医学理论认为哮喘的发病机理为痰伏于肺，痰气交阻，闭塞气道，肺失宣降。哮喘病位主要在肺，同时也关系到脾、肾、肝、心 [3]。麻黄定喘汤是出自《张氏医通》中治疗哮喘的中药复方，由麻黄、厚朴、杏仁、款冬花、桑皮、苏子、甘草、黄芩、半夏九味药组成。中药复方具有多成分，作用范围广泛，安全性高等特点，然而现有关于中药复方治疗疾病作用机制的基础研究较少。网络药理学是系统生物学、医学、计算机科学等多学科基础理论与研究方法整合而成的交叉学科，其多成分、多靶点、多途径的网络构建思想为中药复方整体性与系统性作用机制研究提供了有力的理论与技术支撑 [4] [5] [6]。
该研究基于网络药理学技术，从整体角度出发，对麻黄定喘汤潜在活性成分与其治疗哮喘的作用机制展开初步探讨。
2. 材料与方法
2.1. 麻黄定喘汤有效成分与相关靶点筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) [7] 获取麻黄定喘汤中9味中药的化学成分，并根据口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%，类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18两个ADME属性值对其活性成分进行筛选并获得其相应蛋白靶点信息 [8]，并在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将其靶点信息转换为Uniprot ID，从而进行统一规范。
2.2. 哮喘相关靶点筛选
以“asthma”为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(https://www.omim.org)检索有关哮喘的疾病靶点信息，并在DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca)数据库检索临床一线治疗哮喘药物的作用靶点作为哮喘疾病靶点补充。将以上3个数据库中获得的疾病靶点信息进行汇总并剔除重复信息则获得有关哮喘的疾病靶点信息。
2.3. 药物–成分–靶点网络的构建与分析
将麻黄定喘汤中9味药的活性成分与其对应靶点导入Cytoscape3.7.2中构建“药物–成分–靶点”网络，根据连接度(Degree)，介度(Betweenness Centrality)与紧密度(Closeness Centrality)对网络进行分析，连接度，介度与紧密度越高，说明该节点在网络中发挥的作用越重要。
2.4. 麻黄定喘汤作用靶点–哮喘靶点PPI网络构建
利用FunRich3.1.3中的Venn Diagram功能构建麻黄定喘汤作用靶点与哮喘靶点交集靶点Venn图。利用String11.0数据库(https://string-db.org)对交集靶点构建蛋白质相互作用(PPI)网络 [9]，在String11.0数据库中选择物种为“Homo sapiens (人类)”，设置最小互相作用阈值“highestconfidence” > 0.9，隐藏网络中的游离节点，其余设置保持默认选项，分析得到PPI网络。将PPI网络分析结果保存为TSV格式，导入Cytoscape3.7.2中利用MCODE插件对PPI网络进行进一步分析，挖掘其潜在蛋白质功能模块。
2.5. 麻黄定喘汤治疗哮喘靶点功能与通路的富集分析
将麻黄定喘汤治疗哮喘的靶点导入Metascape平台(https://metascape.org/gp/index.html) [10]，设定P < 0.01，进行基因本体(GO)富集分析与京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。
3. 结果
3.1. 麻黄定喘汤活性成分与靶点的筛选
在TCMSP数据库中，以OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18为标准筛选得到麻黄定喘汤有效化学成分188种，其中麻黄22种，甘草85种，黄芩29种，桑皮19种，款冬花13种，半夏7种，苏子7种，杏仁4种，厚朴2种，主要有效成分见表1。根据有效成分筛选结果，在TCMSP数据库后续检索得到有效成分相关作用靶点247个。
Table 1. Main active ingredients of Mahuang Dingchuan decoction
表1. 麻黄定喘汤主要活性成分
3.2. 哮喘相关靶点的获取
以“asthma”为关键词，在GeneCards，OMIM，DRUGBANK数据库中分别检索到980个，101个，104个相关靶点。其中GeneCards数据库中初始检索获得疾病相关靶点过多，而在GeneCards数据库中，Score越低则代表该靶点与疾病相关性越差，故根据经验以Score大于等于中位数为标准对Score过低靶点进行剔除。最终合并3个疾病数据库检索结果并剔除重复靶点后获得1051个哮喘相关疾病靶点。
3.3. 药物–成分–靶点网络的构建与分析
Cytoscape3.7.2网络分析结果显示麻黄定喘汤有效成分中卡维丁(Cavidine)连接度为154，介度为0.2345，紧密度为0.5807，新隐丹参酮(coniferin)连接度为97，介度为0.0526，紧密度为0.4489，高丽槐素(Inermine)连接度为83，介度为0.0427，紧密度为0.4338，槲皮素(quercetin)连接度为50，介度为0.0689，紧密度为0.4205。预测卡维丁，新隐丹参酮，高丽槐素与槲皮素为麻黄定喘汤中关键成分。
3.4. 麻黄定喘汤作用靶点–哮喘靶点PPI网络的构建
将筛选出的麻黄定喘汤活性成分相关靶点与哮喘相关靶点取交集，通过FunRich3.1.3中的Venn Diagram功能绘制Venn图，见图1。获得交集靶点120个，交集靶点导入String11.0数据库，构建药物–疾病交集靶点PPI网络，见图2。
使用Cytoscape3.7.2中的MCODE插件对PPI网络进行进一步分析，MCODE为分子复合物检测算法，该算法可检测大型PPI网络中潜在的密集连接区域，该区域称为Module，即蛋白质功能模块 [11]。以MCODE Score为标准保留两个最佳评分Module，见图3。
3.5. 麻黄定喘汤治疗哮喘靶点富集分析结果
利用Metascape平台对麻黄定喘汤治疗哮喘的相关靶点进行富集分析，分析结果显示麻黄定喘汤可以影响细胞对毒性物质的反应，调控MAPK级联反应，调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，TNF信号通路，NF-κB信号通路等通路。见图4。
4. 讨论
哮喘是由多种细胞包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞与细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病 [12]。目前用于治疗哮喘的药物主要包括β2受体激动剂、抗胆碱能药物、糖皮质激素、短效茶碱等，其中糖皮质激素作为临床使用率最高的治疗哮喘药物，其抗炎作用对哮喘的发作有良好抑制作用，但其物质代谢特点带来了一系列潜在风险，如肌无力、低血钾、浮肿等不良反应 [13]。麻黄定喘汤是出自《张氏医通》中的中药方剂，具有宣肺平喘，清热化痰的功效，其作为中药复方，所含化学成分众多，故其发挥药效的化学成分基础与治疗哮喘的作用机制尚不明确，难以通过单纯的体内或体外实验对其作用机制进行较全面的探讨。
研究利用网络药理学技术对麻黄定喘汤治疗哮喘的有效成分、作用靶点以及相关生物信号通路进行了预测与探讨，初步筛选出麻黄定喘汤治疗哮喘的主要活性成分包括卡维丁、高丽槐素、新隐丹参酮与槲皮素。槲皮素具有广泛的药理作用，其在抗炎、抗病毒、抗癌及预防治疗心脑血管疾病方面均有应用 [14]，相关研究证明，槲皮素在自由基清除，抗过敏以及抗氧化方面活性显著，其主要作用特点包括激活免疫系统、抗病毒、抑制组胺释放、促炎性细胞因子及白三烯生成减少，并抑制IL-4的产生。此外它可以改善Th1/Th2的平衡，并抑制抗原特异性IgE抗体的产生。上述槲皮素的作用机制都有助于其抗炎作用和免疫调节特性，故槲皮素在治疗支气管哮喘，过敏性鼻炎以及花粉等诱导的过敏反应上有相当好的效果 [15]。
Figure 1. Intersection target of Mahuang Dingchuan decoction and asthma
图1. 麻黄定喘汤与哮喘交集靶点
卡维丁属于异喹啉生物碱，它是一种具有抗炎活性的选择性环氧化酶-2 (COX-2)抑制剂。在不同炎症模型动物与脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹膜巨噬细胞中，研究人员发现使用卡维丁进行腹腔注射预处理可以减轻由二甲苯引起的耳水肿与甲醛引起的爪水肿症状，并可降低炎症模型小鼠的白细胞数量、一氧化氮(NO)水平、前列腺素E2 (PGE2)以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平，说明卡维丁具有一定的抗炎活性 [16]。在另一项研究中，相关实验证明卡维丁可以通过抑制促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的产生以及NF-κB信号通路的激活来发挥对肺炎性疾病的预防与治疗 [17]。高丽槐素通过抑制组胺H1受体和IL-4的基因表达来发挥抗过敏作用，它对甲苯二异氰酸酯(TDI)诱导的致敏大鼠模型鼻部症状有所减轻 [18]。新隐丹参
Figure 2. Mahuang Dingchuan decoction-asthma intersection target PPI network
图2. 麻黄定喘汤–哮喘交集靶点PPI网络
Figure 3. Mahuang Dingchuan decoction-asthma intersection target PPI network module
图3. 麻黄定喘汤–哮喘交集靶点PPI网络中的Module
酮在LPS诱导下的小鼠巨噬细胞中展现了抗炎作用，它可通过抑制NF-κB和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)信号通路发挥抗炎作用 [19]。
研究结果显示，麻黄定喘汤治疗哮喘的主要靶点为IL-6、TNF、CHRM3、MAPK1、STAT3等。IL-6是一种前炎症细胞因子，它涉及免疫和炎症反应调节，细胞增殖和分化等。STAT3为核内转录因子，主要通过诱导细胞因子和趋化因子等的表达来介导炎症反应，有学者发现卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘模型小鼠气道内STAT3表达上调和磷酸化激活，其可能促进气道IL-6的升高。气道内IL6/STAT3信号通路可能在气道炎症反应中起到促进作用 [20]。相关研究发现由毒蕈碱受体激活生成的乙酰胆碱可能参与调节与气道重塑相关的病理变化。气道平滑肌中表达较多的毒蕈碱受体亚型为M2与M3，其比例约为4:1，而尽管表达水平相对较低，但毒蕈碱M3受体是负责支气管与器官平滑肌收缩的主要亚型。毒蕈碱受体同时参与气道炎症的调节，乙酰胆碱与其合成酶胆碱乙酰转移酶(ChAT)不仅存在于气道神经上，还存在于上皮细胞和内皮细胞，平滑肌细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞上，这些发现表明乙酰胆碱可以通过旁分泌或自分泌的方式来调控炎症过程，此外，在特应性皮炎患者的皮肤活检中发现乙酰胆碱水平升高，这种疾病通常与支气管哮喘相关联 [21]。毒蕈碱M3受体促进哮喘中血管和神经生长因子的上调，毒蕈碱M3受体由几种肺细胞表达，包括成纤维细胞，由于其分泌神经元和血管生长因子的能力而被认为在哮喘发病时的支气管重塑中起重要作用 [22]。麻黄定喘汤治疗哮喘的通路主要有TNF信号通路，NF-κB信号通路以及MAPK级联反应。MAPK信号途径通过调控免疫反应，炎症细胞和气道结构细胞参与支气管哮喘的发病过程，其主要机制为引起气道高反应和气道重塑，造成Th1/Th2免疫应答失衡。MAPK在激活后可发生磷酸化，继而激活NF-κB，NF-κB为一种转录因子，它与包括支气管哮喘在内的多种炎症反应密切相关。活化后的MAPK和NF-κB信号通路通过促进IL-1β，IL-6，TNF-α以及其他促炎性细胞因子的表达来调控炎症反应 [23] [24] [25]。TNF-α是通过IgE依赖的机制从肥大细胞和巨噬细胞的过敏反应中释放的，其可上调黏附分子，促进炎症细胞向气道内壁迁移，并激活气道上皮细胞的促纤维化机制 [26]。TNF信号通路的生物学效应通过细胞表面的两种TNF受体触发，包括TNFR1与TNFR2。当TNF-α与TNFR1的胞外区结合时，其可产生两种不同的诱导调节机制，包括激活caspase-3诱导细胞凋亡与活化NF-κB调控各种炎症细胞因子的表达，促进炎症反应 [27]。
Figure 4. Mahuang Dingchuan decoction-asthma intersection target GO and KEGG enrichment analysis results
图4. 麻黄定喘汤–哮喘交集靶点GO与KEGG富集分析结果
研究结果体现了麻黄定喘汤治疗哮喘的多成分、多靶点、多通路的整体作用的特点，其可通过影响多个疾病靶点与多条生物信号通路对疾病进行整体调控，而非仅局限于某一方面的作用。运用网络药理学分析预测中药治疗疾病的潜在机制可为中药应用于临床治疗提供一定的科学依据，同时也为挖掘中药及中药复方的作用机制提供了新的技术方向。但该研究主要仅为生物信息学数据分析，缺乏相关体内或体外实验验证，故存在一定局限性。
基金项目
国家自然科学基金资助项目(No. 81860012腺苷酸环化酶AC2亚型在慢性阻塞性肺病疾病发病中的作用及其分子机制研究)。